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Boule基因是DAZ基因家族成员之一,在哺乳动物精子发生过程中发挥重要的调控作用,Boule基因敲除的小鼠精子发生障碍并最终导致雄性不育。实验室前期通过电子克隆和克隆测序获得了牛DAZ家族基因(b-DAZL和b-Boule),并发现b-Boule基因在睾丸组织中特异表达,且黄牛、牦牛睾丸组织中的表达水平显著高于种问杂种(犏牛)。目前关于DAZ家族基因在精子发生过程中的表观遗传学调控的研究主要集中在DAZL基因上,而关于Boule基因表达调控方面的研究还未见报道。为了进一步研究犏牛睾丸组织中b-Boule基因低表达的调控机制,本文拟采用克隆测序技术获得黄牛和犏牛睾丸组织中b-Boule基因启动子区序列和基因内CpG岛序列,采用亚硫酸氢盐测序技术检测黄牛和犏牛睾丸组织中b-Boule基因启动子区和基因内CpG岛甲基化水平的差异；构建启动子区缺失表达载体,采用荧光素酶双报告基因系统检测b-Boule基因核心启动子区的位置；体外甲基化试验验证启动子区甲基化对b-Boule基因表达的影响,以期从表观遗传学角度分析犏牛睾丸组织中b-Boule基因低表达的分子机制,为阐明犏牛雄性不育的机制提供理论依据。1. b-Boule基因的基因组序列分析根据实验室前期获得的b-Boule基因cDNA序列,在牛基因组数据库中进行BLAST搜索,获得78878bp的黄牛b-boule基因的基因组序列(包括6kb的5’侧翼序列和4kb的3’侧翼序列)。电子染色体定位发现b-Boule基因定位于2号染色体,与人BOULE和小鼠Boule基因在染色体间存在高度的保守同线性。基因组结构分析发现b-Boule含有11个外显子和10个内含子。通过生物信息学软件预测发现在b-Boule基因5’端存在四个潜在转录起始位点,分别位于-236bp、-511bp、-725bp和-766bp(以起始密码子ATG为+1)。通过线软件预测发现b-Boule基因存在2个典型的CpG岛：一个位于5’端,长度为2229bp,贯穿于5’非编码区、第1外显子和第1内含子,另一个位于基因内部第5和第6外显子之间,长度为992bp。2. b-Boule基因5’调控序列的克隆与启动子活性分析通过PCR扩增和克隆测序获得了黄牛和犏牛b-Boule基因5’端2400bp启动子序列,同源分析发现,黄牛和犏牛b-Boule基因启动子区核苷酸序列一致100%。首先,构建了4个双荧光素酶缺失表达载体,瞬时转染293细胞,结果发现在b-Boule基因-94bp至-364bp范围内存在正调控元件。为了进一步精确b-Boule基因启动子活性中心,在-94bp至-364bp间又构建了3个荧光素酶表达载体,结果发现b-Boule基因核心启动子位于-66bp至-172bp之间,长度为107bp。转录因子结合位点预测发现b-Boule基因启动子区含有AP-2、Sp-1等转录因子结合位点,其中Spl为甲基化敏感位点。3.黄牛和犏牛睾丸组织b-Boule基因CpG岛甲基化分析采用亚硫酸氢盐测序技术对黄牛和犏牛睾丸组织b-Boule基因核心启动子区DNA甲基化状态进行了分析,结果发现在b-Boule基因核心启动子区含有9个CpG位点,犏牛睾丸组织中b-Boule基因核心启动子区DNA甲基化水平为45.56%(41/90),极显著高于黄牛(16.67%,15/90)(P<0.01),其中第6-8位CpG位点的甲基化水平差异更明显(黄牛为13.67%,犏牛为83.33%),结合实验室前期睾丸组织mRNA表达水平和组织学观察结果,推测启动子甲基化在b-Boule基因的表达调控中发挥关键作用,犏牛b-Boule基因核心启动子区的高甲基化可能与犏牛精子发生障碍、雄性不育有关.黄牛和犏牛睾丸组织b-Boule基因内CpG岛甲基化状况分析结果显示：表明黄牛和犏牛睾丸组织b-Boule基因内CpG岛DNA甲基化水平差异结果差异不显著(P>0.05)。4. b-Boule基因启动子区体外甲基化分析为了进一步研究b-Boule基因核心启动子区甲基化对b-Boule基因表达水平的影响,构建了包括核心启动子区在内的表达载体,采用CpG甲基转移酶(M.SssI)进行体外甲基化修饰,瞬时转染293细胞,结果发现甲基化修饰后,载体的表达活性极显著降低(P<0.01),说明b-Boule基因核心启动子区甲基化调控了b-Boule基因的表达。