背景肿瘤是严重威胁人类健康的一类疾病,寻找有效的抗肿瘤药物与方法是世界医学界的重要研究课题。研究表明许多中药具有抗肿瘤作用,但其作用成分复杂,具有多种作用成分和通过多种作用途径产生抗肿瘤作用。弄清中药的抗肿瘤作用途径和靶位点对加速抗肿瘤中药的开发具有重要意义。近50年来尽管肿瘤治疗取得了一些进展,化疗、放疗、手术仍是治疗基本手段。但是由于现有的化疗药物和放疗的选择性不高,杀伤肿瘤细胞的同时也损害体内正常细胞,治疗中常出现较明显的毒副反应,所以研究、开发一种对肿瘤细胞选择性高、杀伤作用强但对正常组织副作用小的抗肿瘤药物非常有意义。免疫毒素是提高治疗效果的一条重要途径,是新一代的癌症治疗方法,此疗法与传统的化疗不同,其药物能在肿瘤部位有相对较高的浓度,存留较长时间,对肿瘤靶细胞有较强的杀伤活性,而对正常细胞无作用或毒性很小,免疫毒素是靶向性治疗肿瘤的有代表性的药物,也是免疫学研究的热点之一,被称为“生物导弹”,近年来利用基因工程技术构建了不同用途的免疫毒素。免疫毒素是具有导向能力的分子（载体）和具有细胞毒性的分子（毒素）构成的具有特异性细胞杀伤能力的杂合分子。载体一般由抗体、细胞因子和激素等组成,毒素一般为来自于细菌或植物。载体可以把毒素定向带到病灶部位,将癌细胞或病变细胞杀死,而很少伤害正常细胞。研究表明,免疫毒素在体内具有靶向性,使毒素更易于与肿瘤细胞结合,大大提高了毒素对肿瘤细胞的杀伤率,降低了其对正常细胞的毒副作用。天花粉蛋白（trichosanthin,TCS）是从葫芦科植物栝蒌的根块中提取出来的一种碱性蛋白,属于Ⅰ型核糖体失活蛋白（ribosome inactivating proteins,RIPs）。天花粉蛋白临床主要用于引产及宫外孕、葡萄胎、绒癌等的治疗,另外使核糖体不可逆失活,从而抑制蛋白质的合成,其应用范围已涉及抗病毒、抗肿瘤等方面,同时可抑制艾滋病病毒在感染的免疫失活细胞内复制繁衍,此外还发现在培养的细胞系统中,TCS对乙脑、乙肝、麻疹、单纯疱疹及水泡性口腔炎等病毒均有明显抑制作用,并且这种抑制作用与TCS的浓度呈正相关。但是由于天花粉蛋白在临床上使用所产生的副作用,限制了它进一步的推广和应用,我们可以考虑如何在TCS不引发过敏反应的剂量内,最大限度的发挥其抗肿瘤作用,这就需要我们找到一种能与TCS一起最大限度发挥协同杀伤肿瘤细胞的物质。表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor,EGFR）的异常高表达可见于多种恶性肿瘤,并与肿瘤细胞的恶性生物学行为以及肿瘤患者的不良预后密切相关。EGFR已成为阳性表达肿瘤的重要治疗靶标。以EGFR为靶点的治疗主要有单克隆抗体以及小分子化合物激酶拮抗剂两种方式,目前已进行了广泛的实验与临床研究,其抗肿瘤的主要作用机制包括:细胞周期阻滞、促凋亡、抗肿瘤浸润与转移、抗新生血管生成、放化疗细胞毒增敏等。此外,以人EGFR为免疫原在小鼠体内可以激发特异的免疫反应,该反应能交叉反应于鼠同源EGFR,进而达到治疗EGFR阳性表达肿瘤的目的。迄今,EGFR靶向治疗均很少观察到显著的EGFR相关的毒副作用,这可能与正常细胞EGFR显著的调控性低表达以及对EGFR通路信号的相对不依赖性相关。为此,本研究以传统中药天花粉蛋白为毒素,人表皮生长因子为载体,利用基因工程技术,制备重组免疫毒EGF-Linker-TCS,并对其靶向性抗肿瘤作用给予评价,为中医药在抗肿瘤方面的应用进行了有益的探索,对促进中药开发、中药现代化具有一定的意义。目的1、因天花粉蛋白成分复杂,纯化步骤繁琐,得率低,目前构建的携带有天花粉蛋白基因的表达载体其表达水平较低,并且费用昂贵,为后续的研究带来困难。本实验拟通过基因工程技术,摸索出可以高效、稳定、简单、廉价的制备高纯度融合蛋白TCS、EGF-TCS、EGF-Linker-TCS的方法。2、对正常人肝LO-2细胞、肝癌BEL-7402细胞、乳腺癌MCF-7细胞和胃腺癌BGC-823细胞表面EGF受体表达量进行检测,探讨EGF作为靶向抗肿瘤免疫毒素载体的可能性。3、通过结晶紫法,计算TCS、EGF-TCS、EGF-Linker-TCS对正常人肝LO-2细胞、肝癌BEL-7402细胞、乳腺癌MCF-7细胞和胃腺癌BGC-823细胞的半数抑制有效浓度(IC₅₀)及其选择指数、应用流式细胞仪对TCS、EGF-TCS、EGF-Linker-TCS选择性诱导细胞凋亡的研究,对TCS、EGF-TCS、EGF-Linker-TCS的体外靶向抗肿瘤作用给予评价。4、研究免疫毒素EGF-Linker-TCS对建立荷人肝癌BEL-7402细胞的裸鼠模型,研究肿瘤生长抑制及移植肿瘤的肝转移情况,对EGF-Linker-TCS的体内靶向抗肿瘤作用给予评价。方法1、克隆、表达、纯化TCS、EGF-TCS、EGF-Linker-TCS融合蛋白提取栝蒌基因组,使用PCR方法扩增TCS基因,将TCS基因插入到pQE30载体中,构建TCS的原核表达质粒pQE30/TCS;使用PCR方法扩增EGF基因,将EGF基因插pQE30/TCS中,构建原核表达质粒pQE30/EGF-TCS;考虑到融合蛋白中间加Linker可能会使两个蛋白更好的保持各自的构象,更好的保持各自的生物学活性,使用PCR方法扩增了EGF-Linker基因,将EGF-Linker基因插入pQE30/TCS中,构建了原核表达质粒pQE30/EGF-Linker-TCS,分别进行基因测序。将这三个重组质粒转化至M15工程菌中诱导表达,SDS-PAGE重组蛋白在M15工程菌中的表达,检测表达量占菌体蛋白总量。将鉴定的重组质粒pQE30/TCS、pQE30/EGF-TCS、pQE30/EGF-Linker-TCS转化至M15工程菌中,挑单菌落接种于含Amp50μg/ml LB培养基中,摇床培养,至OD值为0.6时,分别加入IPTG诱导表达,取样做SDS-PAGE分析。IPTG诱导大肠杆菌表达TCS、EGF-TCS、EGF-Linker-TCS 3h,超声波破碎菌体,离心后取上清液,用Ni-NTA Agrose亲和纯化,检测样品的纯度。2、正常细胞和肿瘤细胞的EGF受体表达量的检测EGF和TCS构成的融合蛋白靶向性抗肿瘤的靶点是EGF受体,使用流式细胞仪对正常细胞和肿瘤细胞表面的EGF受体表达量进行检测。3、TCS、EGF-TCS、EGF-Linker-TCS对正常细胞及肿瘤细胞的半数抑制有效浓度(IC₅₀)及其选择指数的确定采用结晶紫法检测纯化的TCS、EGF-TCS、EGF-Linker-TCS对肿瘤细胞和正常细胞的细胞毒作用,测定其对细胞的半数抑制有效浓度(IC₅₀)及其选择指数。按以下公式计算杀伤率:杀伤率（%）=[（对照孔A值-实验孔A值）/对照孔A值]×100%,通过计算细胞生长的抑制百分率,用origin 6.0软件计算出IC₅₀,并根据IC₅₀值计算出选择指数:选择指数=IC₅₀（正常细胞）/IC₅₀（肿瘤细胞）。4、流式细胞仪检测EGF-TCS、EGF-Linker-TCS选择性诱导细胞凋亡情况EGF-TCS和EGF-Linker-TCS可以通过EGF受体结合肿瘤细胞,TCS可以使肿瘤细胞的核糖体失活,蛋白合成抑制而死亡。TCS除了核糖体失活,有可能还有其它机制导致真核细胞死亡,我们使用流式细胞仪观察EGF-TCS、EGF-Linker-TCS诱导LO-2、BEL-7402、MCF-7和BGC-823细胞的凋亡作用。5、电镜观察EGF-Linker-TCS对肝癌BEL-7402细胞凋亡的影响使用电镜观察EGF-Linker-TCS对肝癌BEL-7402细胞的影响,进一步研究EGF-Linker-TCS诱导细胞凋亡的机制。6、EGF-Linker-TCS对裸鼠的肿瘤模型的体内抑瘤实验分别给裸鼠右腋皮下接种人肝癌BEL-7402细胞,接种后第6天,尾静脉注射100μg/kg、50μg/kg和25μg/kg EGF-Linker-TCS进行治疗,设空白对照组,停药后第2天处死小鼠,称量瘤重,计算抑瘤率,取出肝脏计算肿瘤转移灶。肿瘤组织用10%甲醛固定做免疫组织化学实验,从而研究其抑制肿瘤生长、转移的途径。结果1、TCS、EGF-TCS、EGF-Linker-TCS融合蛋白的制备对pQE30/TCS、pQE30/EGF-TCS和pQE30/EGF-Linker-TCS三个质粒分别进行基因测序,测序结果表明与设计一致;将这三个重组质粒转化至M15工程菌中,诱导表达,SDS-PAGE结果表明重组蛋白在M15工程菌中以可溶性形式表达,表达量均占菌体蛋白总量的30%。免疫印迹分析结果显示,重组蛋白可与特异性抗体发生特异性免疫反应。纯化的样品纯度均超过95%。2、正常肝细胞和肿瘤细胞的EGF受体检测使用流式细胞仪对正常肝细胞和肿瘤细胞的EGF受体进行了检测,检测结果显示正常肝LO-2细胞EGF受体阳性表达量为5.51%,肝癌BEL-7402细胞EGF受体阳性表达量为72.33%,乳腺癌MCF-7细胞EGF受体阳性表达量为63.92%,胃腺癌BGC-823细胞EGF受体阳性表达量为70.41%。肿瘤细胞的EGF受体数量明显高于正常细胞。3、TCS、EGF-TCS、EGF-Linker-TCS对正常细胞及肿瘤细胞的半数抑制有效浓度(IC₅₀)及其选择指数结果结果显示:TCS对LO-2、BEL-7402、MCF-7和BGC-823细胞的IC₅₀分别为39.70μg/ml、33.37μg/ml、36.53μg/ml、41.52μg/ml,对BEL-7402、MCF-7和BGC-823细胞选择指数分别为1.19、1.09、0.96;EGF-TCS对LO-2、BEL-7402、MCF-7和BGC-823细胞的IC₅₀分别为115.34μg/ml、8.90μg/ml、13.75μg/ml、15.36μg/ml,对BEL-7402、MCF-7和BGC-823细胞选择指数分别为12.96、8.39、7.51;EGF-Linker-TCS对LO-2、BEL-7402、MCF-7和BGC-823细胞的IC₅₀分别为113.99μg/ml、6.98μg/ml、11.97μg/ml、13.53μg/ml,对BEL-7402、MCF-7和BGC-823细胞选择指数分别为16.33、9.52、8.43。实验的结果符合我们的设计,EGF-TCS和EGF-Linker-TCS对肿瘤细胞的IC₅₀要小于TCS,而对正常细胞的IC₅₀与TCS接近,EGF-TCS和EGF-Linker-TCS的选择指数高于TCS,均大于2,符合靶向药物的要求,EGF-Linker-TCS对肿瘤细胞的IC₅₀低于EGF-TCS,选择指数高于EGF-TCS。4、EGF-TCS、EGF-Linker-TCS诱导肿瘤细胞凋亡作用流式细胞仪检测结果显示:EGF-TCS对乳腺癌MCF-7细胞、胃腺癌BGC-823、肝癌BEL-7402细胞的凋亡率分别为35.61%、39.59%、50.57%,同样的剂量只能引起正常肝LO-2细胞少量的凋亡,凋亡率仅为8.99%,结果表明EGF-TCS（5μg/ml）具有诱导肿瘤细胞产生凋亡的作用;EGF-Linker-TCS（5μg/ml）也同样具有诱肿瘤细胞乳腺癌MCF-7细胞、胃腺癌BGC-823细胞、肝癌BEL-7402细胞凋亡的作用,凋亡率分别为:36.67%、42.56%、58.56%,同样的剂量只能引起正常肝LO-2细胞少量的凋亡,凋亡率仅为8.08%。5、电镜观察EGF-Linker-TCS对BEL-7402细胞的影响电镜下可见对照组细胞核清晰完整,有丰富正常的线粒体及内质网;EGF-Linker-TCS蛋白组出现细胞凋亡不同时期特征,染色质浓集,核不规则,可见空泡状内质网,凋亡小体。6、EGF-Linker-TCS对荷人肝癌裸鼠肿瘤模型体内的抑瘤实验为了进一步观察重组毒素的抗肿瘤效果,我们使用EGF-Linker-TCS重组蛋白对裸鼠的肿瘤模型进行了体内的抑瘤实验,结果表明EGF-Linker-TCS能明显的抑制裸鼠实体瘤的生长。高、中和低剂量组的抑制率分别为71.3%、60.87%和45.22%,对治疗结束后各组平均瘤重进行统计学分析,说明EGF-Linker-TCS能明显的抑制裸鼠实体瘤的生长,结果有显著性差异（F=8.712P=0.006）;同时我们也观察了药物对移植肿瘤肝转移的抑制情况,解剖裸鼠检查肝脏,可见移植瘤转移到肝脏后呈现单个的白色病灶,对每只裸鼠的肝转移病灶计数后进行统计学分析,结果表明EGF-Linker-TCS能显著的抑制裸鼠移植瘤肝脏转移,结果有显著性差异（F=8.744 P=0.002）;免疫组化结果显示EGF-Linker-TCS可以明显的抑制肿瘤血管的形成,高剂量组肿瘤组织未有可见血管,中低剂量组肿瘤组织血管明显少于模型组,其抑制肿瘤生长、转移的途径可能是通过抑制肿瘤血管生长来抑制肿瘤生长及转移。结论经上述研究,可以得出以下结论:1、通过基因工程技术,摸索出了可以高效、稳定、简单、廉价的制备高纯度融合蛋白TCS、EGF-TCS、EGF-Linker-TCS的方法,为下一步研究其生物学功能奠定了基础。2、在很多肿瘤细胞表面EGF受体过度表达,EGF可以特异地结合肿瘤细胞过度表达的EGF受体,可以用于免疫毒素的导向。3、通过TCS、EGF-TCS、EGF-Linker-TCS对肿瘤细胞体外靶向杀伤作用的研究,证明EGF-TCS、EGF-Linker-TCS对肿瘤细胞具有良好的选择性,选择指数大于2,并且具有较高的细胞毒性,对正常细胞的细胞毒性要小于TCS。4、免疫毒素EGF-Linker-TCS能明显抑制肝癌动物模型肿瘤生长及肿瘤的肝转移,说明EGF-Linker-TCS对实体瘤作用明显。