【摘 要】
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目的:筛选FOXF2作用于结肠癌细胞中Wnt/β-catenin信号通路的候选靶基因并分析其功能,为进一步研究FOXF2调控Wnt/β-catenin信号通路活性相关的靶基因提供依据。方法:1.设计干扰FOXF2的3条靶点序列,分别构建慢病毒介导的FOXF2基因沉默sh RNA载体,将获取的慢病毒FOXF2-sh RNA-1、2、3分别转染人源结肠癌HT29细胞,并用嘌呤霉素进行抗性筛选,RT-q
【基金项目】
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国家自然科学基金（81360366）; 贵州省科技计划项目（黔科合基础[2020]1Z064）
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目的:筛选FOXF2作用于结肠癌细胞中Wnt/β-catenin信号通路的候选靶基因并分析其功能,为进一步研究FOXF2调控Wnt/β-catenin信号通路活性相关的靶基因提供依据。方法:1.设计干扰FOXF2的3条靶点序列,分别构建慢病毒介导的FOXF2基因沉默sh RNA载体,将获取的慢病毒FOXF2-sh RNA-1、2、3分别转染人源结肠癌HT29细胞,并用嘌呤霉素进行抗性筛选,RT-q PCR、Western blot验证各组慢病毒沉默FOXF2的效果,选定最佳干扰慢病毒稳定转染获得的HT29细胞株为实验组,空载体慢病毒转染获得的HT29细胞株为对照组。2.分别对实验组和对照组的三个样本进行转录组测序,对已知基因和新基因进行定量分析,筛选表达明显上调或下调的m RNA,将测序获得的差异表达基因作层次聚类、GO以及KEGG富集分析,筛选Wnt/β-catenin信号通路中的候选靶基因并分析其可能参与的生物学过程。3.利用RT-q PCR、Western blot对候选靶基因进行相对定量检测,验证转录组测序的可靠性。4.利用GEPIA数据库中结肠癌和正常结肠组织数据集对FOXF2及相关候选靶基因进行表达分析,并对FOXF2与相关候选靶基因的表达进行相关性分析。结果:1.成功构建干扰慢病毒载体;与空载体慢病毒相比,干扰慢病毒FOXF2-sh RNA-1、2、3均可明显降低HT29细胞中FOXF2的m RNA和蛋白水平,其中FOXF2-sh RNA-3沉默效果最显著。2.转录组测序发掘新基因2210个,具有GO、KEGG功能注释的分别有979个、409个;差异表达基因共有389个,包含221个上调基因,168个下调基因;对照组和实验组之间存在差异性,同一类样本的基因可以聚类出现在同一个簇中,聚类在同一个簇中的基因具有相同或相似的生物学性质;差异表达基因显著富集免疫效应过程、细胞外区域、腺苷酸转移酶活性等功能集团;差异表达基因主要涉及EB病毒感染、甲型流感及Wnt信号通路等;Wnt/β-catenin信号通路中共有7个差异表达基因,其中BAMBI、LGR5、LGR6、MSTRG.14182（新基因）4个基因得到功能注释,主要涉及正向调控Wnt信号通路、线粒体钙离子稳态、细胞增殖和迁移等生物学过程。由于MSTRG.14182为新基因,国内外文献未能查阅到相关信息,因此选定BAMBI、LGR5、LGR6作为Wnt/β-catenin信号通路的候选靶基因。3.与对照组相比,实验组中的BAMBI、LGR5、LGR6在m RNA和蛋白水平均呈现上调趋势（P＜0.05）。4.GEPIA数据库生信分析结果显示,与正常结肠组织相比,结肠癌组织中FOXF2表达明显下调,而BAMBI、LGR5、LGR6表达明显上调（P＜0.05）;在结肠癌中,FOXF2与BAMBI、LGR5的表达呈负相关（依次R=-0.12,P=0.035;R=-0.12,P=0.029）,而FOXF2与LGR6的表达具有负相关趋势,但未达到统计学意义（R=-0.071,P=0.21）。结论:1.沉默FOXF2基因的HT29细胞存在较多的差异表达基因,Wnt/β-catenin信号通路的候选靶基因可能参与正向调控Wnt信号通路、细胞增殖以及迁移等生物学过程。2.BAMBI、LGR5、LGR6基因是FOXF2作用于结肠癌细胞中Wnt/β-catenin信号通路的候选靶基因;生信分析预测,在结肠癌中FOXF2与BAMBI、LGR5表达呈负相关,与LGR6表达具有负相关趋势。
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