【摘 要】
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鸡胚蛋含有丰富的生物活性成分如蛋白质、脂质、矿物质和维生素等,对于鸡胚的正常生长发育具有重要意义。其中,蛋清和蛋黄蛋白质是鸡胚发育过程中的主要蛋白源。近些年,研究者们陆续报道了孵化过程中的鸡蛋蛋清、蛋黄、蛋壳膜、羊水以及胚胎组织器官的差异蛋白质组,有助于全面了解在鸡胚发育过程中鸡蛋蛋白质的变化情况。胚胎的生长发育与动物胚胎中蛋白质的糖基化修饰密切相关,然而不同孵化时期的鸡蛋蛋白质以及糖蛋白的定量分
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鸡胚蛋含有丰富的生物活性成分如蛋白质、脂质、矿物质和维生素等,对于鸡胚的正常生长发育具有重要意义。其中,蛋清和蛋黄蛋白质是鸡胚发育过程中的主要蛋白源。近些年,研究者们陆续报道了孵化过程中的鸡蛋蛋清、蛋黄、蛋壳膜、羊水以及胚胎组织器官的差异蛋白质组,有助于全面了解在鸡胚发育过程中鸡蛋蛋白质的变化情况。胚胎的生长发育与动物胚胎中蛋白质的糖基化修饰密切相关,然而不同孵化时期的鸡蛋蛋白质以及糖蛋白的定量分析鲜有报道。为了探究鸡胚孵化期间,鸡胚蛋的蛋白质组及N-糖基化水平的变化情况,本研究以不同孵化时期的鸡胚蛋蛋清和蛋黄混合蛋白质为研究对象,利用串联质量标签（TMT）标记技术、高效液相色谱分级技术、N-糖基化肽段富集技术以及基于质谱定量蛋白质组学技术的有机结合,分析不同孵化时期鸡蛋蛋白质、N-糖基化蛋白质以及小分子肽的变化情况,并通过生物信息学分析,探讨了这些蛋白含量的变化与鸡胚发育之间的内在联系。主要研究结果如下:（1）采用定量蛋白质组学（TMT标记）技术对孵化期间第0 d和第12 d蛋清和蛋黄蛋白质进行了定量蛋白组分析,共鉴定到592种蛋白质,其中以1.2倍为变化阈值,在孵化12 d丰度值发生显著上调的蛋白质有163种,显著下调的蛋白质有56种（P＜0.05）。基于GO、亚细胞定位、功能富集分子和蛋白组互作网络等分析结果,发现上调蛋白主要与能量交换、代谢和糖原分解有关,下调蛋白主要与调节、免疫和防御过程有关。这些差异蛋白与鸡胚建立自身的防御系统、细胞骨架以及生物调节有关。（2）通过Pro-Q Diamond和SYPRO荧光染色电泳对孵化期间总蛋白和N-糖基化蛋白的变化情况进行分析,发现N-糖基化蛋白在第0 d和第12 d之间的蛋白灰度差异最大。随后利用定量蛋白质组学（TMT标记）技术对孵化期间第0 d和第12 d蛋清和蛋黄蛋白质进行定量N-糖蛋白组学研究。共鉴定到位于153种蛋白上的334个N-糖基化位点。以1.2倍为变化阈值,P＜0.05为标准,29种蛋白的33个N-糖基化位点发生显著上调,53种蛋白的76个N-糖基化位点发生显著下调（P＜0.05）。本研究发现鸡蛋中的糖蛋白存在大量非保守糖基化位点（N-X-N/V/A/I）。这些差异变化的N-糖基化蛋白质主要是具有结合、转运和应激反应功能的蛋白质,对于维持孵化期间蛋白质的结构稳定性,以及与鸡胚发育过程中的糖原供给、受体运输和信号转导密切相关。（3）归一化处理后在蛋白组和N-糖蛋白组同时鉴定到44种N-糖蛋白肽段,进而分析发现N-糖蛋白在孵化12 d后发生显著变化一方面是由于本身N-糖基化程度发生变化,一方面也可能是因为蛋白丰度的变化而发生改变。虽然某些糖蛋白在糖蛋白组没有发生显著变化,但是经过归一化处理后,这些糖蛋白的糖基化水平是具有显著变化的。这表明归一化的处理对于探究糖基化变化的实质是十分有必要的。对归一化后N-糖基化差异蛋白进行GO分析,发现这些差异变化的糖蛋白可能与鸡胚发育过程中的应激反应和防御体系有关。（4）利用MALDI-TOF MS/MS研究不同孵化时期鸡胚蛋蛋清中的小分子多肽之间的差异,分别在孵化第0、6、14和16 d得到837、879、872和842条肽段（共3430条）。孵化前期检测到的肽段主要来源于与抗菌抗病毒能力相关的蛋白质,而后期多是来自于与鸡胚胎发育过程中呼吸系统和防御系统相关的蛋白质。这些在孵化期间被鸡蛋自身内源酶逐渐水解的肽段,一部分继续发挥着某种特定功能,如抗菌和抗病毒等;一部分则被胚胎吸收利用,有助于鸡胚建立自身呼吸系统和防御系统等。
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