CX3CL1对胰腺癌细胞糖代谢的影响及其机制研究

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目的糖代谢,是人体的三大代谢途径之一,是维持机体稳态的重要代谢途径。在正常细胞中,葡萄糖是维持细胞生长的主要能源物质。糖酵解是生物体内普遍存在的能量代谢过程。在有氧情况下,机体细胞通过有氧氧化获得三磷酸腺苷(ATP),糖酵解收到抑制,然而在许多恶性肿瘤中,即使氧供应充分,糖酵解也十分活跃。Warburg早在1930年就发现了这一现象,此即Warburg效应。与正常细胞相比,肿瘤细胞具有增殖活跃,生长迅速,能量需求大的特点。作为主要能源物质的葡萄糖对于肿瘤细胞来说具有更加重要的功能,因此干预肿瘤细胞中的葡萄糖代谢必然会对肿瘤细胞的生长产生重大影响。胰腺癌为高度恶性的乏血管肿瘤,其组织中有高丰度的HIF-1a表达,而HIF-1a在肿瘤细胞缺氧自适应过程中对肿瘤细胞的糖代谢起着重要调节作用。CX3CL1是趋化因子CX3C家族的唯一成员。CX3CR1是CX3CL1唯一的受体。CX3CL1除了具有粘附和趋化的双重功能外,CX3CL1对多种恶性肿瘤(包括胰腺癌)的生长、侵袭和转移中可能发挥抗肿瘤或者促肿瘤的作用。然而,目前尚无研究证明CX3CL1是否对胰腺癌的糖代谢产生影响。对肿瘤细胞糖代谢机制的研究,将有助于发现新的治疗靶点。在我们的前期工作中发现:CX3CL1具有增强胰腺癌细胞糖酵解的功能,促进其葡萄糖摄取及乳酸分泌。同时,先前研究已经证明CX3CL1可以激活细胞内HIF-1a水平的增高。结合先前HIF-1a在肿瘤糖代谢重要的调节作用。我们推测CX3CL1可能通过HIF-1a水平的变化来促进胰腺癌细胞的糖酵解水平。因此,本研究旨在探讨CX3CL1对胰腺癌细胞葡萄糖摄取及乳酸分泌的影响;CX3CR1在CX3CL1调节胰腺癌细胞的糖代谢变化的作用。CX3CL1与体内信号通路、HIF-1a表达关系;CX3CL1是否依赖HIF-1a表达变化调节胰腺癌细胞的糖代谢变化。方法一、明确CX3CL1对胰腺癌细胞葡萄糖摄取及乳酸分泌的影响1.利用不同浓度的外源性重组人源性CX3CL1处理胰腺癌细胞系MiaPaCa-2及Panc-1细胞24小时,检测并计算葡萄糖摄取量及乳酸分泌量;2.构建pEGFP-CX3CL1过表达质粒,并将其转染到胰腺癌细胞系;3. MiaPaCa-2及Panc-1中过表达CX3CL1,检测并计算葡萄糖摄取量及乳酸分泌量。二、研究CX3CL1通过是否CX3CR1调节胰腺癌细胞的糖代谢变化1.采用Western-blot及流式细胞仪技术各细胞系的CX3CR1的基础表达;2.利用特异性CX3CR1的siRNA转染细胞,利用Western-blot及流式细胞仪技术筛选出干扰效率最高的siRNA;3.利用干扰效率最高的siRNA转染胰腺癌细胞系,给予外源性人CX3CL124处理小时后,检测并计算检测并计算葡萄糖摄取量及乳酸分泌量。三、研究CX3CL1激活的体内的信号通路及其相互关系1.利用Western-Blot技术检测,给予外源性人CX3CL1刺激后,细胞内p-MAPK、p-AKT、HIF-1a及β-actin变化;2.给予p-MAPK和p-AKT的特异性抑制剂PD98059和LY2940002预处理后,利用Western-Blot技术检测,给予外源性人CX3CL1刺激后,细胞内p-MAPK、p-AKT、HIF-1a及β-actin变化;3.利用Vestern-Blot及PCR技术检测,干扰CX3CR1后,HIF-1a及VEGF的变化。四、CX3CL1依赖HIF-1a表达变化调节胰腺癌细胞的糖代谢变化1.利用、Vestern-blot技术筛选出干扰效率最高的特异性HIF-1a的siRNA;2.利用干扰效率最高的特异性HIF-1a的siRNA转染胰腺癌细胞系,给予外源性人CX3CL124处理小时后,检测并计算检测并计算葡萄糖摄取量及乳酸分泌量。3.利用干扰效率最高的特异性HIF-1a的siRNA转染胰腺癌细胞系,给予外源性人CX3CL1刺激后,利用RT-PCR技术检测GLU-1的表达。结果无论是外源性及内源性的CX3CL1均可以促进胰腺癌细胞的葡萄糖摄取及乳酸摄取:作为CX3CL1的特异性受体CX3CR1,均表达在个胰腺癌细胞系中;利用siRNA干扰后,可以发现CX3CL1通过CX3CR1来促进胰腺癌细胞的糖酵解;同时,CX3CL1可以激活PI3K/Akt和MAPK信号途径促进HIF-1a表达;利用siRNA干扰后,可以发现CX3CL1通过调节HIF-1a表达来促进胰腺癌细胞的糖酵解;CX3CL1可以促进糖酵解途径的关键酶GLUT-1的表达,HIF-1a在其中其重要的调节作用。结论CX3CL1/CX3CR1轴通过激活PI3K/Akt和MAPK信号途径促进HIF-1a表达来增强胰腺癌细胞的糖酵解;CX3CL1/CX3CR1/HIF-1a信号途径是胰腺癌细胞能量代谢的一种重要机制,有可能成为治疗胰腺癌的潜在靶点。
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