研究背景：获得性免疫缺陷综合征(Acquired immunodeficiency syndrome, AIDS),又称为艾滋病,它是由人类免疫缺陷病毒(Human immunodeficiency virus, HIV-1)引起的,会造成人类免疫系统缺陷的一种逆转录病毒,该种病毒会破坏人免疫系统,最终导致一系列的机会性感染和肿瘤。随着抗逆转录病毒治疗方案的完善和全球对AIDS治疗的各种投入,AIDS己成为一种慢性可控的感染性疾病,艾滋病人的寿命极大地延长。但是,由于艾滋病人寿命的延长,携带HIV的人数持续上升,感染者呈老龄化趋势,而且只有大约1/5的感染者能享受药物治疗。因此,感染者/发病者所面临的各种并发症极大的影响了病人的生存质量。眼部并发症是HIV-1感染者最常见的症状之一,眼部表现往往是HIV-1患者全身播散性感染的首要表现,大约45%-75%的HIV-1患者眼部会受到侵犯,临床上把眼部并发症作为HIV-1症状检测的一个指标,甚至有少数患者作为首发症状就医。大多数的HIV-1感染者的视网膜发病都会出现视网膜微血管渗漏、神经纤维层变薄、内皮细胞肿胀、血管网状结构等病理特征。视网膜病变严重威胁着艾滋病人的视力,使患者的色觉分辨能力、调节能力和对比敏感度能力有不同程度的下降,严重时会导致患者失明。由于在无或者有眼科症状的HIV-1感染者的视网膜组织内部的各层细胞中都检测到HIV-1的抗原,因此,HIV-1直接进入视网膜结构被认为是导致HIV视网膜并发症的主要原因。艾滋病不可治愈,最主要原因是HIV病毒能潜伏在人的各个组织和器官中,抗逆转录病毒治疗不能杀灭潜伏的病毒。密西西比女婴“功能性治愈”失败的例子和科学家在猴子感染模型上的实验证明,即使在感染早期给予感染者抗病毒药物治疗,当治疗停止后,病毒仍然会复苏。这些结果提示,病毒能在感染早期阶段就建立HIV储存库,清除病毒储存库是治愈艾滋病的关键问题。除了CD4+T淋巴细胞,神经系统、视网膜、睾丸等都是HIV-1潜伏的理想之所。人视网膜色素上皮细胞(human retinal pigment epithelium, HRPE)位于视神经网膜和脉络膜毛细血管层之间,依靠完整的细胞间紧密链接,构成血—视网膜外屏障。血—视网膜外屏障类似血脑屏障,可选择性调节视网膜神经组织的局部微环境,保护视网膜神经细胞不受血液中炎症细胞及细胞毒性产物的影响。因此血-视网膜外屏障对调节视网膜的微环境,维持其稳态起重要的作用。我们前期研究中表明,HIV长时间作用于HRPE (48 h),病毒包膜蛋白gp120会诱导HRPE的炎症反应,从而导致HRPE屏障功能的破坏并且HRPE的通透性增加。但是,我们进一步研究表明,HIV-1短暂作用于HRPE后,2小时即可在细胞内检测到病毒的核心抗原p24。病毒除了通过旁通路影响HRPE的功能,病毒很可能直接感染HRPE。本文选择视网膜色素上皮细胞作为研究对象,深入探讨HIV-1进入视网膜色素上皮细胞的途径以及病毒进入细胞后发生的分子事件,期望阐明病毒致视网膜疾病的机制及病毒在视网膜中建立潜伏感染的机制,寻找潜在的药物靶点。研究目的：通过体外培养的D407细胞,建立体外的视网膜上皮细胞屏障模型。利用流式细胞技术、western blotting、共聚焦显微镜等多种方法研究病毒进入D407细胞,采用化学抑制剂的方法探讨病毒进入D407细胞的具体机制,采用PCR技术检测病毒在D407细胞中的整合作用,利用溶酶体的标记物和溶酶体中的蛋白酶抑制剂等检测病毒在细胞内的转运过程；最后通过共培养的方式来检测病毒在细胞-细胞间的传播。本文旨在探讨HIV-1进入视网膜色素上皮细胞的机制以及病毒进入细胞后发生的分子事件。预期阐明病毒致视网膜疾病的机制及病毒在视网膜中可能建立的潜伏感染,寻找潜在的药物治疗靶点。研究方法：1.克隆病毒的制备及其感染力的检测1)将SF162(R5受体嗜性)病毒全长基因的质粒和NL4-3(X4受体嗜性)病毒全长基因的质粒,分别转染至293TX细胞中制备感染性克隆病毒。2)将转染得到的HIV-1克隆病毒分别稀释2、4、8、16、32、64倍六个浓度,100分μl/孔,加入到提前12h铺好的TZM-B1细胞的96孔板中,48 h后用luciferase报告基因检测试剂盒检测。2.检测D407细胞表面受体的表达1)流式细胞仪检测：D407铺板36 h后,用0.025%的EDTA消化细胞,PBS重悬,1 μg/ml anti-CD4、anti-CCR5、anti-CXCR4的抗体4℃孵育1 h,1 μg/ml的鼠源性二抗4℃孵育40min, PBS重悬后,流式细胞仪检测。2) RT-PCR检测：依据基因组试剂盒的说明书,提取D407细胞的基因组,参考文献设计CD4、CXCR4、CCR5等受体基因的引物序列,基因组直接进行RT-PCR实验,用7500软件查看各样品的溶解曲线和循环数。3.检测HIV-1能否感染D407细胞1)ELISA检测(以R5受体嗜性的病毒为例)：将病毒处理CEMX1745.25M7细胞和D407细胞6 h,胰酶消化收集细胞,PBS洗涤3次,培养基重悬,1×105个/孔铺板,分别在第1、3、5、7天取500μ1上清裂解,用ELISA检测上清中p24的含量。4.检测HIV-1能够进入D407细胞1)流式细胞仪检测：将D407细胞2×105个/孔铺板,12 h后加入EGFP标记的HIV-1,37℃孵育2 h,胰酶消化、重悬,PBS混悬均匀,上机检测。2) Western blotting检测：将D407细胞2×105个/孔铺板,24 h后分别加入不同的HIV-1,37℃孵育2 h,胰酶消化、重悬、离心,PBS洗涤3次,用细胞裂解液RIPA裂解、收集蛋白,检测核心抗原p24蛋白。3)共聚焦显微镜检测：将D407细胞2×105个/孔铺板,24 h后分别加入EGFP标记的克隆病毒,37℃孵育1h, PBS洗涤3次,加入2 gM的DiI(染细胞膜的红色荧光染料)染色10min, PBS洗涤3次,4%的多聚甲醛固定15 min,PBS洗涤3次,DAPI染细胞核,在荧光共聚焦显微镜上观察不同荧光所在的位置。5.HIV-1进入D407细胞的机制研究1)流式细胞仪检测：将D407细胞2×105个/孔铺板,孵育24 h后,分别加入不同的化学抑制剂处理细胞1 h,加入EGFP标记的R5受体嗜性的克隆病毒,处理1 h,胰酶消化、重悬,PBS混悬均匀,上机检测。2) Western blotting检测：将D407细胞2×105个/孔铺板,孵育24 h后,加入不同浓度的各种抑制剂,处理1 h,加入克隆病毒,处理1 h,胰酶消化、重悬,离心,PBS洗涤3次,用细胞裂解液RIPA裂解、收集蛋白,检测核心抗原p24蛋白。6.检测进入D407细胞的病毒滞留情况1) Western blotting检测：将D407细胞2×105个/孔铺板24 h后,加入50μM的Pepastatin A和Leupeptin处理细胞,去掉药物,加入1000 ng/ml的HIV-1处理1h,分别在0h、5h、10h、20 h和30 h收集细胞,处理后,用细胞裂解液RIPA裂解、收集蛋白,检测核心抗原p24蛋白;运用相同的方法检测病毒处理D407细胞30min、60 min、90min和120 min时,细胞内EEAl的变化情况。2)荧光显微镜检测：将D407细胞2×104个/ml,接种于共聚焦的培养皿中,24 h后,分别加入50μM的PepastatinA和Leupeptin以及R5受体嗜性的HIV-1处理1 h,去上清,PBS洗涤3次,4%的多聚甲醛固定15 min,100%的乙醇通透10 min,加入100μl稀释后的EEA1抗体(溶酶体标记蛋白)4℃孵育过夜,PBS洗涤3次,加入CY3标记的鼠源性二抗室温孵育1h,PBS洗涤3次,在荧光显微镜上观察。3)PCR检测病毒的整合：将D407细胞2×105个/孔铺板,24 h后,加入病毒孵育48 h,收集细胞,提取基因组,用普通PCR和RT-PCR检测：运用相同的实验方法,检测逆转录酶的抑制剂对HIV-1整合的影响。7.检测HIV在D407细胞和T淋巴细胞间的感染1)Transwell实验：将D407细胞2×105个/孔铺板,24 h后,加入HIV-1 SF162,处理1 h,胰酶消化、重悬,离心,PBS洗涤3次,用培养基重悬,将其重新铺板到transwell上室中,下室加入CEMX174 5.25M7细胞,以正常的六孔板作为阳性对照,48 h培养后,用流式细胞仪和ELISA检测病毒的感染情况,在相同的实验条件下,用各种抑制剂处理D407细胞,检测病毒感染靶细胞的情况。实验结果：1.加入荧光病毒处理的D407细胞中,用荧光共聚焦显微镜可以在细胞内部检测到荧光病毒。随着加入病毒孵育时间的延长,进入D407细胞累积的病毒先增加后减少达到一个稳定的值,在1 h出现最大值;在37℃和4℃的环境中,进入D407细胞的病毒有显著性的差异,在4℃时基本没有病毒进入细胞；D407受体检测时,D407细胞上CD4、CXCR4、CCR5三种受体的表现出来的荧光强度和空白组一致,而阳性细胞(U87·CD4·CCR5、MT-2、TZM-B1)表现出来的荧光强度与阴性对照相比有显著的差别；2. Western blotting检测时,只有氯丙嗪、氯化铵、奎宁、蔗糖等这一类Clathrin通路抑制剂对HIV-1进入D407细胞有抑制作用,并且有较好的线性相关性；而孕酮、阿米洛利、木杉酮、T-20等Caveolae、Macropinocytosis和融合抑制剂对HIV-1进入D407细胞没有显著地影响。3.HIV-1进入细胞以后,细胞内的病毒量随着时间的延长而逐渐减少；病毒进入溶酶体,被降解；有部分进入的病毒释放其遗传物质,病毒整合进入D407细胞的基因组中,这个整合过程可以被逆转录酶的抑制剂(AZT)所阻断。4.HIV-1克隆病毒可以在CD4+细胞中复制,并产生自代病毒,但不能在D407细胞中复制；用transwell隔开的内含有病毒的D407不能感染CEMX1745.25M7,而正常共培养的细胞则可以感染CEMX174 5.25M7细胞；病毒在D407细胞和CEMX174 5.25M7细胞中的传播能被氯丙嗪和CCR5抑制剂阻断。实验结论：1.HIV-1能够以不依赖于CD4受体和CXCR4/CCR5辅助受体的方式进入D407细胞,并且这种进入的方式受时间和能量的影响。2.HIV-1进入视网膜色素上皮细胞是Clathrin介导的内吞过程。3.HIV-1进入视网膜色素上皮细胞后会发生溶酶体的降解,并且病毒的基因可以整合到视网膜色素细胞基因组中。。4.HIV-1进入视网膜色素上皮细胞后可通过细胞-细胞间的传播方式感染淋巴细胞,并且此过程可能是Clathrin和CCR4介导的。