乌鳢水泡病毒（snakehead vesiculovirus,SHVV）的感染导致我国乌鳢养殖业重大经济损失,目前还没有有效的防治措施。病毒的非编码RNA在病毒感染过程中发挥重要的调节作用,因而发掘病毒的非编码RNA并阐明其调节病毒增殖的分子机制是揭示病毒致病机理以及防治该病毒病的重要基础。在本研究中,我们建立了SHVV的反向遗传操作系统,鉴定出SHVV在感染过程中能产生名为Leader RNA的非编码RNA。通过构建Leader RNA缺失突变株以及过表达Leader RNA两种方式发现Leader RNA能促进SHVV增殖。进一步研究发现,Leader RNA与病毒N蛋白互作促进SHVV增殖。本研究主要结果如下:1.SHVV反向遗传操作系统的建立反向遗传操作系统是研究病毒致病机制及研制疫苗的重要技术手段。为了建立SHVV反向遗传操作系统,我们首先构建了包含病毒基因组cDNA的质粒,以及编码N、P、L蛋白的辅助质粒。然后将这些质粒按照一定的比例共转染293T细胞,转染3天后转接至斑点叉尾鮰卵巢细胞（channel catfish ovary,CCO）,通过western blot检测到病毒蛋白以及TCID₅₀检测病毒滴度,结果表明rSHVV拯救成功。比较野生病毒株（wtSHVV）与重组病毒株（rSHVV）的增殖曲线,发现wtSHVV和rSHVV的增殖能力没有显著差异。反向遗传操作系统的建立为后期构建Leader RNA缺失突变病毒株奠定基础。2.SHVV Leader RNA的鉴定在水生动物病毒中,目前还没有关于Leader RNA的报道。本研究以实验室分离的SHVV为研究对象,对SHVV是否产生Leader RNA进行鉴定。首先,对SHVV感染的CCO细胞进行小RNA测序,发现SHVV感染CCO细胞能产生三组Leader RNA(分别命名为le_group1、le_group2、le_group3)。为了排除细胞的影响,对SHVV感染的条纹月鳢细胞（Striped snakehead cell,SSN-1）进行小RNA测序,测序结果与CCO细胞的结果基本一致,充分证实了SHVV在感染过程中能产生三组Leader RNA。针对小RNA测序结果,我们对Leader RNA的转录起始和终止位点进行RT-PCR验证,验证结果与小RNA测序结果基本一致。同时,我们发现随着病毒的增殖,le_group1和le_group3的表达量显著增加,而le_group2的表达量没有明显变化。3.Leader RNA对SHVV增殖的影响为了构建缺失Leader RNA的突变株,我们对三组Leader RNA的转录起始位点进行突变。结果发现突变le_group1和le_group2的转录起始位点无法拯救出病毒,突变le_group3的转录起始位点（38-42 nt）成功拯救了突变株(rSHVV-mut_38-42)。我们对突变株产生Leader RNA的情况进行检测,发现突变株感染CCO细胞只能产生le_group1,无法产生le_group2和le_group3。比较rSHVV-mut_38-42与rSHVV的增殖能力发现没有显著性差异,表明le_group2和le_group3对SHVV的增殖不是必须的。根据产生的三组Leader RNA分别合成三条Leader RNA(le_1-22,le_19-48,le_41-65)以及对照NC（negetive control）,通过qRT-PCR、western blot以及TCID₅₀检测都发现le_1-22可以显著促进病毒增殖,而le_19-48,le_41-65没有明显促进效果。同时,发现le_1-30也具有促进病毒增殖的作用,表明le_group1对病毒增殖发挥重要的作用。4.le_group1与病毒蛋白互作对SHVV增殖的影响为了探究le_group1促进病毒增殖的机制,我们研究了le_group1对干扰素、炎症因子表达的影响。结果表明过表达le_group1对干扰素、炎症因子的表达没有显著影响。进一步研究发现,le_group1可以促进病毒基因组RNA的转录和复制来促进病毒增殖。影响病毒基因组RNA的转录和复制可能与某个病毒蛋白互作相关,我们的研究发现,le_group1能与5个病毒蛋白中的N蛋白直接互作。为了研究le_group1与N蛋白互作对病毒增殖的影响,将病毒N蛋白的真核表达质粒与le_1-22单独/同时转染CCO细胞后感染SHVV,通过检测发现,le_group1与N蛋白互作可以促进SHVV增殖。进一步研究发现,le_group1与N蛋白互作可以促进病毒基因组RNA的转录和复制,进而促进病毒增殖。为了探究le_group1与N蛋白互作的关键区域,我们将病毒N蛋白分段表达并纯化,利用EMSA确定N蛋白的第1-45位氨基酸是与le_1-22互作的关键氨基酸。我们合成分段缺失的le_1-22,发现Leader RNA的第6-12位核苷酸为互作的关键区域。并且发现le_group1与N蛋白互作的区域与病毒基因组RNA与N蛋白结合的区域不同。