阿尔茨海默病(Alzheimer’s diseaseAD)是一种在老年期发生的以进行性痴呆为主要特征的神经元退行性疾病。其主要临床表现为进行性认知功能障碍和记忆力衰退，性格和行为改变，判断力下降，社交障碍，生活自理能力丧失，最终死亡。AD是继心血管疾病、癌症和中风之后的第四大杀手，严重危害着老年人的身体健康和生活质量。近一个世纪以来，许多科学家就AD的确切病因及发病机制进行了不倦的探索和研究，但因其致病因素复杂而至今尚不十分清楚。目前认为，AD是由遗传学因素、环境因素和代谢因素等多种因素共同作用所引起的一种病理过程。其主要的组织病理学改变包括：神经元纤维缠结(neurofibrillarvtangles，NFTs)，神经炎斑(neuritic plaques，NP或老年斑senile plaques，SP)，神经元丢失，淀粉样血管改变(amyloid angiopathy)。同时伴有乙酰胆碱、去甲肾上腺素、5-羟色胺、谷氨酸盐、生长激素释放抑制因子和P物质等多种神经递质脑内浓度的减少，其中具有特征性的病理现象是神经炎斑和神经元纤维缠结的形成。神经炎斑的核心成分β淀粉样蛋白(amyloid beta-protein，Aβ)，它的结构及功能一直是科学工作者研究的焦点。大量资料表明，Aβ是一种神经毒性物质，可以引起神经元的损伤、死亡，在AD的发病中起着相当重要的作用。 Aβ是各种细胞的正常产物，在溶解状态下可能具有促进细胞生长的作用，其生理作用目前还知之不多。Aβ在水溶液中以α螺旋、随机螺旋和β片层结构三种形式混合存在。其中β片层结构可促进Aβ单体聚集，形成淀粉斑块。当APP基因发生突变或环境因素、代谢因素作用，引起Aβ表达增加 (尤其是Aβ42、Aβ43合成增多)，在杏仁核、海马及新皮质等部位的浓度增高，作用时间延长，以及局部体液异常，从而导致β片层结构生成，促进Aβ聚集，沉积在这些区域。Aβ形成聚合物后具有细胞毒性作用，引起神经元变性、死亡，突触丢失。Aβ对神经细胞的毒性作用机制复杂，存在着多种机制，包括细胞凋亡、钙超载、氧化应激和炎症反应等。 目前治疗AD主要是基于减轻痴呆症状，常用药物包括胆碱酯酶抑制剂(如他克林、石杉碱甲)，钙通道拮抗剂，抗氧化剂和神经营养因子(如NGE，BNDF)等。炔醇是一类重要的天然十七碳仲醇，存在于人参Panax ginseng，三七P.notoginseng等药用植物和番茄、胡萝卜等水果蔬菜中。近年来，人们发现炔醇具有抗癌、降压、抗菌等生物活性。本课题组在常用中药中筛选神经营养和神经保护活性成分时，发现中药三七的乙醇提取物及其脂溶性部位具有神经营养和神经保护作用。我们在进一步的植物化学研究和药理学研究中首次发现中药三七中存在天然炔醇的代表化合物人参炔醇(panaxynol，PNN)和人参环氧炔醇(panaxydol，PND)，并证明这两个炔醇是三七脂溶性部位神经营养和神经保护作用的重要活性成分。本课题在以往研究的基础上直接采用Aβ25-35蛋白在体外损伤原代大脑皮层神经元，考察PNN和PND的神经保护作用及其机制；另外，以PC12细胞为模型，考察PND促神经细胞轴索生长作用及其机制，从神经保护和神经营养两方面来考察PNN和PND预防、减轻和治疗老年痴呆症的可能性。研究工作主要包括以下三部分：第一部分人参炔醇和人参环氧炔醇对Aβ25-35损伤大脑皮层神经元的保护作用Aβ是AD患者老年斑的主要成分，对神经元具有毒性作用。本课题我们采用外源性Aβ25-35损伤原代培养的SD大鼠胚胎大脑皮层神经元模型，观测人参炔醇和人参环氧炔醇对神经元的保护作用，并研究其作用机制。通过显微操作，我们取得胎龄16天的SD大鼠胚胎的大脑皮层组织，经0.05％胰酶消化后用滴管吹打可得大量分散的神经细胞。神经元用NeuroBasal添加2％B27的培养液培养。通过MTT实验我们发现，PNN和PND预孵育24小时后再用10μmol/LAβ25-35损伤48小时，浓度范围为1.25-10／μmol/L的PNN和PND对Aβ25-35的毒性有拮抗作用。我们通过TUNEL和Hoechst标记检测凋亡细胞，也发现5μmol/L PNN和PND预处理24小时可以拮抗10μmol/L Aβ25-35引起的细胞凋亡，使凋亡细胞减少约20％。同样，western blot检测发现PNN和PND可以一定程度上抑制Aβ25-35引起的抗凋亡蛋白Bcl-2下降和凋亡蛋白Bax升高。有研究表明，Aβ可以作为神经元的增殖信号，驱动神经元进入细胞周期，但不能通过S期的检验点，而被阻滞在G1期，从而引起细胞死亡。 第二部分人参炔醇和人参环氧炔醇对硝普钠(SNP)损伤大脑皮层神经元的保护作用 过量的NO被认为是多种中枢病变的因素之一。有研究表明Aβ可以激活神经元nNOS和胶质细胞iNOS产生过量的NO，从而对神经元产生毒性。本课题我们采用外源性NO供体硝普钠(SNP)模拟Aβ诱导产生过量NO损伤神经元实验，考察PNN和PND对NO引起细胞损伤的保护作用。通过MTT和LDH实验我们发现，PNN和PND预孵育24小时后再用1 mmol／L SNP损伤1小时，一定浓度范围内的PNN和PND对SNP的毒性有拮抗作用。通过Hoechst标记检测凋亡细胞，也发现5／mmol／L PNN和PND预处理24小时可以拮抗SNP引起的细胞凋亡，可减少约17％的细胞凋亡。同样，western blot检测发现PNN和PND可以一定程度上抑制SNP引起的抗凋亡蛋白Bcl-2下降和凋亡蛋白Bax升高。证明PNN和PND对过量NO引起的毒性也有拮抗作用，间接证明了PNN和PND抗Aft25．35毒性的另一条途径。 第三部分人参环氧炔醇促PC12轴索生长的信号转导研究 PC12细胞是源于大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤(rat adrenal pheochromocytomal的细胞株，是一种较理想的研究作用于神经细胞药物的模型。在某些神经营养因子如神经生长因子(NGF)作用下，PC12细胞可分化为具有交感神经元某些特性的细胞，表现为轴索生长。本课题进一步明确PND可剂量依赖地促进PC12细胞轴索生长，并对PND促进轴索生长的机制尤其依赖于cAMP但不依赖于PKA的信号转导通路进行了研究。据文献报道NGF主要通过RTK-RAS-MEK-ERK通路促进PC12细胞轴索生长，垂体腺苷酸环化酶激活多肽(PACAP)作用于PC12细胞时，通过cAMP／Rapl／B-Raf信号通道实现了cAMP-PKA和MAPK两条信号通路间的串话(cross-talk)，从而导致了PACAP的“NGF”样作用。我们通过使用信号转导通路上一些关键激酶的抑制剂，发现RTK抑制剂genistein和SU5416可以很好抑制NGF促轴索生长的作用，但不能抑制PND促PC12轴索生长；腺苷酸环化酶(AC)抑制剂SQ22536和cAMP依赖的蛋白激酶抑制剂RpcAMPS可抑制AC激动剂Forskolin和PND促轴索生长的作用，ERK抑制剂UO126也可抑制PND促轴索生长的作用；PKA抑制剂H89可明显抑制Forskolin促轴索生长的作用，但不能抑制PND促轴索生长的作用。另外，PKC非特异性抑制剂H7，JNK抑制剂SB203580，P38MAPK抑制剂SP600125，P13K抑制剂LY294002均不能抑制PND促PC12细胞轴索生长。我们进一步用western blot检测了PND及其各通道关键激酶抑制剂对Erk活化的影响，进一步明确了PND促进轴索生长的信号通路。发现PND可以促进Erk和CREB活化。另外我们还发现PND可以引起钙离子和cAMP轻微升高。通过这些结果我们得出结论：PND 主要通过Ca<'2+>／cAMP-Epac-Rapl-MEK-ERK-CREB通路发挥促轴索生长的作用，而该作用不依赖PKA。 炔醇存在于多种人们常用的药(食)用植物中，深入研究其药理作用及其作用机制既可以阐明这些植物活性作用的物质基础，又可以指导人们合理使(食)用这些植物。由于炔醇在植物界的广泛存在，又同时具有神经保护和神经营养作用，可能成为较理想的神经营养和神经保护药物的先导化合物，并可能进一步转化为治疗老年退行性病变药物的候选化合物。本研究对炔醇类化合物新颖作用机制的深入研究对于发现药物作用的新靶点奠定了基础，因此既具有学术价值又具有社会意义。