【摘 要】
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植食性害虫的发生对全球作物产量造成严重威胁,产生巨大经济损失。抗虫作物育种和应用是增加作物产量、提升作物品质和减少农药依赖的一个重要途径,而借助基因工程手段通过基因编辑,创制抗虫种质为抗虫育种提供新的解决方案,但目前抗虫基因匮乏,在很大程度上限制了基因工程技术应用,成为植物抗虫育种工作的瓶颈。因此,挖掘植物抗虫基因,开发新型绿色防治手段显得尤为重要。本文以拟南芥为研究材料,获得了一个参与植物抗作物
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植食性害虫的发生对全球作物产量造成严重威胁,产生巨大经济损失。抗虫作物育种和应用是增加作物产量、提升作物品质和减少农药依赖的一个重要途径,而借助基因工程手段通过基因编辑,创制抗虫种质为抗虫育种提供新的解决方案,但目前抗虫基因匮乏,在很大程度上限制了基因工程技术应用,成为植物抗虫育种工作的瓶颈。因此,挖掘植物抗虫基因,开发新型绿色防治手段显得尤为重要。本文以拟南芥为研究材料,获得了一个参与植物抗作物主要害虫-小菜蛾的关键基因RPX1,并探究了其抗虫作用机制。主要结果如下:（1）RPX1基因突变显著影响鳞翅目害虫小菜蛾的生长和繁殖。气味选择性实验结果显示,rpx1-1拟南芥植株对小菜蛾具有驱避效果,在强制性取食实验中,喂食rpx1-1的小菜蛾死亡率、谷胱甘肽-S-转移酶和细胞色素P450酶活显著升高,化蛹率降低,而喂食RPX1回补转基因材料与野生型对照没有差别,表明RPX1参与植物对小菜蛾的防御过程。（2）rpx1-1喂食的小菜蛾幼虫肠道受损。用野生型Col-0,rpx1-1及RPX1/rpx1-1回补转基因拟南芥喂食小菜蛾幼虫,开展“Smurf”实验,结果发现,喂食rpx1-1的肠道受损染料留存的小菜蛾比例显著增加;体式镜下显微解剖围食膜结构,显微观察发现,喂食rpx1-1后的幼虫肠道内围食膜结构疏松;幼虫肠道石蜡横切切片显示,在喂食rpx1-1后,幼虫肠道内围食膜完整性遭到破坏。（3）RPX1主要通过PEN1增强对拟南芥的抗性。rpx1-1突变体转录组分析显示RPX1参与调控倍半萜与三萜生物合成,其中包括三个差异表达基因MRN1、THAS和PEN1。气相质谱分析显挥发性物质示DMNT在rpx1-1突变体中显著累积。在对PEN1-ami R/rpx1-1和35Spro:PEN1/Col-0转基因植株强制性喂食实验后发现,与突变体rpx1-1相比,喂食PEN1-ami R/rpx1-1的小菜蛾死亡率显著降低,肠道受损程度显著减弱,并且幼虫肠道内围食膜结构恢复完整。表明PEN1可能在RPX1基因的下游发挥作用,在rpx1-1中PEN1基因表达量升高引起DMNT积累是毒杀小菜蛾的主要原因之一。（4）DMNT可由根部运输到叶片。组织表达模式分析可知PEN1基因主要在根中表达,同时亚细胞定位分析发现PEN1在根尖的中柱鞘细胞信号较强。利用DMNT体外运输实验获得的野生型Col-0叶片强制性喂食小菜蛾,与DMSO对照相比,DMNT处理植物的叶子导致更高的幼虫死亡率和更低的化蛹率。在DMNT转运的独立验证实验即人工合成得氘（2H）标记的DMNT（DMNT-H~2）体外运输实验结果显示,DMNT-H~2在剔除根的叶片中高度富集。表明DMNT能够作为小分子从拟南芥的根部运输到地上部分,参与地上组织对小菜蛾的抗性。（5）小菜蛾侵食能诱导RPX1降解,增强拟南芥的抗性。q RT-PCR分析显示小菜蛾侵染野生型Col-0中RPX1基因转录水平没有变化,而蛋白免疫印迹与荧光强度分析发现,小菜蛾侵染的RPX1pro-GFP/rpx1-1和35Spro-RPX1-Flag/Col-0株系中RPX1蛋白量均显著减少;采用激光共聚焦观察小菜蛾侵染RPX1pro-GFP/rpx1-1后的荧光信号较对照明显减弱,表明小菜蛾侵食能诱导RPX1降解。同时,通过JA、SA和Wounding处理RPX1pro-GFP/rpx1-1后,SA和Wounding同样能使RPX1蛋白水平降低。由此可知小菜蛾诱导RPX1降解可能与SA和Wounding途径相关,从而使植物在被害虫侵害后引起PEN1的表达量升高,以增强对小菜蛾的抗性。综上所述,本研究通过对RPX1基因突变体材料进行转录组分析和挥发性差异代谢物检测,从而获得参与rpx-1-1抵抗小菜蛾过程的下游调控因子PEN1及其功能分析,并进一步探究了小菜蛾诱导的PRX1降解在植物防御中的功能。
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