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目的:在大范围地揭示出健脾益气法下调大鼠肝癌高表达基因谱的基础上,关注其中信号转导相关基因国际研究进展,以及率先克隆出该治法下调显著EST片段的cDNA完整表达序列,为进一步揭示中医治疗肝癌重要法则——健脾益气法作用机制奠定基础。
方法:采用基因芯片技术检测不同中医治法对大鼠肝癌基因转录的调节作用,进一步筛选出芯片结果中健脾益气法下调的有关信号转导基因,并跟踪国际最新研究进展;同时分别采用经典的cDNA文库筛选,以及电子克隆与PCR相结合的筛选方法,克隆出有关EST片段的cDNA完整表达序列。
结果:(1)本研究发现在各不同中医治法中,健脾益气法对大鼠肝癌基因转录调整的面最宽,其中健脾益气法能明显下调的基因高达689个;(2)从基因芯片结果中,本研究筛选到健脾益气法明显下调的信号转导有关已知基因19个;(3)运用经典的cDNA文库筛选方法,成功筛选出编号为G9的EST片段的完整cDNA序列;(4)采用EST电子克隆技术与PCR技术相结合的方法,成功筛选出11个EST片段的cDNA序列(G2、G4、G5、G6、G11、G14、G15、G16、G17、G18、G20),在克隆出的11新基因中,经进一步BLAST对比分析,证明G14、G15、G20等3个基因为新基因,并进行GenBank等录,分别命名为:大鼠肝癌中健脾益气药物下调的基因GDY14、GDY15、GDY20,登录号分别为DQ480745、DQ480746、DQ480747。
讨论:本研究成功运用AffymetrixRat230A生物芯片大通量的检测不同中医治法对大鼠肝癌基因转录水平上的差异,在国内外率先发现一批不同中医治法能明显调整的基因。同时,本研究在充分利用生物信息学资源的基础上,成功克隆出4个中医健脾益气法能明显调控的新基因的cDNA序列,这为今后进一步深入观察这些基因的功能,以及深入探讨不同中医治法的作用机制打下良好的研究基础,也为中医药基础研究的国际化开展了成功的尝试。