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研究目的近年来,随着在胰腺癌中证实有肿瘤干细胞(CSC)的存在,对胰腺癌复发、侵袭转移形成产生了新的认识和研究方向。中药干预胰腺癌干细胞的研究也越来越多。本研究通过体外探讨人参炔醇(PNN Panaxynol)对胰腺癌干细胞增殖活性的作用,并进一步探讨其对胰腺癌干细胞侵袭转移能力及干性的影响,从而为人参炔醇干预治疗胰腺癌进一步提供有效的理论依据及实验基础。研究方法本研究通过以肿瘤干细胞表面标记分子CD133为筛选标记,从胰腺癌细胞系Panc-1细胞中分离出CD133阳性细胞,在体外通过检测细胞周期及干性相关蛋白Oct4、CD133的表达进一步进行鉴定。然后用人参炔醇干预胰腺癌干细胞,CCK-8实验筛选出最佳作用浓度及时间；进而探讨其对胰腺癌干细胞侵袭转移及体外分化的作用。(1)无血清培养法培养和富集胰腺癌细胞系Panc-1干细胞。采用流式细胞术检测培养的胰腺癌Panc-1细胞的表面标记分子CD133表达情况。(2)采用流式细胞分选术分选及鉴定胰腺癌干细胞；将分选出的细胞培养于无血清的培养基中,适时传代。(3) Western-Blot检测分选出的CD1334+细胞内干性相关蛋白Oct4及CD133的表达情况。(4)流式细胞周期实验观察分选出的CD133+细胞的周期分布情况。(5)采用CCK-8实验观察胰腺癌干细胞经人参炔醇干预后其增殖活性的影响,筛选其最佳作用浓度及时间。(6) Transwell侵袭及迁移实验观察胰腺癌干细胞经人参炔醇干预后其迁移及侵袭能力的影响。(7) Western-Blot检测胰腺癌干细胞经人参炔醇干预后其增殖相关蛋白PCNA及迁移相关蛋白E-Cadherin、N-Cadherin及Vimentin表达的变化。(8)采用流式细胞术检测胰腺癌干细胞经人参炔醇干预后其干细胞表面标记分子CD133的变化。(9) Western-Blot检测胰腺癌干细胞经人参炔醇干预后其干性相关蛋白Oct4及CD133表达的变化。研究结果(1)无血清培养法培养一段时间后,细胞呈球生长,流式细胞术结果表明无血清培养法能够有效的富集CD133表型的胰腺癌细胞。(2)流式细胞分选术分选出的CD133+细胞纯度>98%。(3) Western-Blot检测分选出的CD133+细胞内干性相关蛋白Oct4及CD133表达明显高于对照组。(4)流式细胞周期试验显示CD133+细胞大多处于细胞周期静止期(G0/G1期)。(5)CCK-8实验显示人参炔醇可以抑制胰腺癌干细胞的增殖活性并且呈浓度依赖性,且以人参炔醇浓度为80μg/mL作用48h后作用最明显。(6) Transwell实验结果显示人参炔醇可以有效抑制胰腺癌干细胞的迁移及侵袭能力并且呈浓度依赖性,且以其浓度为80μg/mL作用48h后作用最明显。(7) Western-Blot结果显示胰腺癌干细胞经人参炔醇干预后其增殖相关蛋白PCNA表达下调,迁移相关蛋白E-Cadherin表达上调及N-Cadherin、 Vimentin表达下调。(8)流式细胞检测结果显示胰腺癌干细胞经人参炔醇干预后CD133表达减少。(9)Western-Blot结果显示胰腺癌干细胞经人参炔醇干预后其干性相关蛋白Oct4及CD133表达下调。结论(1)本研究使用干细胞表面标记分子CD133成功分选和鉴定胰腺癌干细胞,分选出的CD133+细胞具有明显的干细胞特性。(2)本研究主要在体外证实人参炔醇能够有效的抑制胰腺癌干细胞的迁移及侵袭能力,此作用主要与抑制了胰腺癌干细胞的增殖活性及上皮-间质细胞转化(EMT)有关。(3)本研究主要在体外证实人参炔醇可促进胰腺癌干细胞体外分化、抑制其干性。而这一作用可能与人参炔醇抑制了胰腺癌干细胞EMT过程相关。为胰腺癌的临床治疗提供了有效的实验依据。