双酚A（Bisphenol A，BPA）学名2，2-二（4-羟基苯基）丙烷，是世界已知重要的环境雌激素之一。BPA是人工合成的高分子材料的单体，是生产塑料增塑剂、农药、涂料等化工产品的原料。在婴儿奶瓶、饭盒、玩具及自来水管等材料中广泛存在。双酚A单体可从盛装食物或饮料的塑料容器中游离出来，在高温或强酸碱等条件下可加速游离过程。BPA暴露人群非常广泛，流行病学研究表明，超过90%的个体尿中可检测到BPA。BPA的化学结构与乙烯雌酚类似，进入体内可模拟雌激素活性。目前欧盟、美国和中国等众多国家只是禁止含BPA的塑料用于制造婴儿奶瓶，实际上，青春期前的儿童BPA暴露也是一个值得关注的问题。这个时期是生殖系统发育成熟前的一个关键阶段。这个时期的儿童可能通过多种途径暴露于BPA，特别是发生食品和饮水污染事件时，儿童还可能会短期暴露于较高浓度的BPA。尽管环境雌激素与天然激素相比在体内的浓度较低，但由于处于发育期的儿童下丘脑－垂体－性腺轴尚未发育成熟，体内性激素水平比较低，此时的个体对外源性雌激素的反应较成年敏感。同时，较高浓度的BPA对卵巢发育的毒性效应问题也不容忽视。我们推测，青春期前较高浓度BPA短期暴露很可能会影响雌性卵泡的正常发育过程，并且有可能通过影响卵泡发育相关调控基因而发挥作用。本研究通过观察促进卵泡发育的Kitlg、Figla和H1foo基因以及抑制卵泡发育的AMH基因表达的表达和DNA甲基化模式，探讨卵巢发育相关的基因在大鼠BPA短期暴露所致卵巢发育毒性中的作用及其分子生物学机制，为进一步阐明BPA对儿童生殖系统发育的影响提供实验依据。第一部分：青春期前BPA暴露对卵巢发育和功能的影响目的：通过建立青春期前BPA短期暴露的大鼠动物模型，观察BPA对卵巢形态、功能，卵泡细胞的凋亡以及卵巢细胞超微结构等改变，探讨青春期前BPA暴露对卵巢发育和功能的影响。方法：28日龄雌性wistar大鼠通过腹腔注射BPA（10mg/kg、40mg/kg、160mg/kg），每天染毒1次，连续染毒1周。观察卵巢重量、各级卵泡构成、卵泡凋亡（TUNEL）、阴道开放率、第一次动情期出现率、血清性激素水平、卵巢细胞超微结构。结果：1.青春期前大鼠BPA暴露后，染毒组大鼠在各个时间段的体重与对照组比较差异均无统计学意义（P＞0.05）；BPA染毒组的卵巢重量和脏器系数随染毒剂量升高而出现下降，其中40mg/kg和160mg/kgBPA组大鼠卵巢重量与对照组比较有显著性差异（P＜0.01）。2.各染毒剂量组阴道开放率和和首次动情期出现率对照组比较差异均无统计学意义（P＞0.05）。3.随染毒剂量增加，各染毒组大鼠血清雌E2水平有下降趋势，与对照组比较无显著性差异（P＞0.05）。而血清P4水平与对照组比较有显著性差异（P＜0.01），其中，40mg/kg和160mg/kg BPA组血清P4水平下降与对照组比较有显著性差异（P＜0.01）。4.随着染毒剂量升高，各染毒组卵泡数量呈下降趋势，其中10mg/kg、40mg/kg和160mg/kg BPA组与对照组比较差异有统计学意义(P＜0.05，P＜0.01和P＜0.01）；始基卵泡、初级卵泡/腔前卵泡、有腔卵泡和黄体构成比均呈下降趋势，而闭锁卵泡构成比有升高趋势，其中40mg/kg和160mg/kg BPA组与对照组比较差异有统计学意义（P＜0.01）。5.随染毒剂量的增加，各染毒剂量组中，腔前卵泡、有腔卵泡以及黄体/白体凋亡率均呈现上升趋势，与对照组比较差异均有统计学意义。6.电镜观察卵巢细胞超微结构，与对照组比较，40mg/kg BPA组和160mg/kgBPA组镜下的细胞超微结构显示，细胞内脂肪变性增多，次级溶酶体增多，尤其在160mg/kg BPA组中，大部分细胞胞质中几乎都充斥着脂肪颗粒和次级溶酶体。第二部分：青春期前BPA暴露对卵泡发育相关基因表达的影响目的：青春期前BPA暴露影响卵泡发育过程中，对发育相关基因表达的影响，探讨BPA卵巢毒性的分子机制。方法：整体动物模型同前，用实时荧光定量PCR、Western blot分析以及免疫组化技术检测卵泡发育相关基因：干细胞因子（KITLG）、基础螺旋环转录因子（FIGLA）、卵母细胞特有的H1连结组蛋白(H1FOO)、抗苗勒激素（AMH）的mRNA及其蛋白的表达水平。结果：1.各染毒剂量组Kitlg mRNA相对表达量呈下降趋势，其中160mg/kgBPA组与对照组比较差异具有统计学意义(p﹤0.01)；各染毒剂量组Figla mRNA相对表达量呈下降趋势，其中160mg/kgBPA组与对照组比较差异具有统计学意义(p﹤0.05)；各染毒剂量组H1foo mRNA相对表达量呈下降趋势，与对照组比较差异均具有统计学意义(p﹤0.01)；各染毒剂量组AMH mRNA相对表达量呈上升趋势，其中40mg/kgBPA组和160mg/kgBPA组与对照组比较差异具有统计学意义(p﹤0.05和p﹤0.01)。2. Western blot结果显示，KITLG蛋白表达水平在各BPA染毒组均呈明显下调，其中10mg/kg BPA组和40mg/kg BPA组与对照组比较差异有统计学意义（P＜0.05），160mg/kg BPA组与对照组比较差异有统计学意义（P＜0.01）；FIGLA蛋白表达水平在160mg/kg BPA组呈明显下调，与对照组比较差异有统计学意义（P＜0.05）；H1FOO蛋白表达水平在各BPA染毒组均呈明显下调，其中10mg/kgBPA组与对照组比较差异有统计学意义（P＜0.05），40mg/kg和160mg/kg BPA组与对照组比较差异有统计学意义（P＜0.01）；AMH蛋白表达水平在各BPA染毒组均呈明显上调，其中10mg/kg BPA组与对照组比较差异有统计学意义（P＜0.05），40mg/kg和160mg/kg BPA组与对照组比较差异有统计学意义（P＜0.01）。第三部分青春期前BPA暴露影响卵泡发育的表观遗传学调控机制研究目的：从卵巢细胞DNA总甲基化状态和卵泡发育相关基因启动子区DNA甲基化状态两个方面，初步探讨BPA的表观遗传学的调控机制。方法：整体动物模型同前，卵巢细胞DNA总甲基化采用免疫组化检测卵巢细胞5-甲基胞嘧啶（5-mC）水平。采用亚硫酸氢盐修饰后测序法（BSP）检测卵巢发育相关基因Kitlg启动子区CpG岛的甲基化状况。结果：1.随着染毒剂量的增加，卵巢颗粒细胞5-mC免疫组化的平均光密度值（OD）和积分光密度值（IOD）呈总体上升趋势，其中，40mg/kg BPA组和160mg/kg BPA组与对照组比较差异均有统计学意义(P＜0.05)。2.采用Methprimer软件对以上全部基因的启动子区域进行CpG岛检测，只有Kitlg基因启动子区存在一个CpG岛，35个甲基化位点。Kitlg基因BSP产物重组T载体质粒的测序结果显示，随着染毒剂量增加，发生Cs的个数呈上升趋势，其中，160mg/kg BPA组Cs的甲基化率与对照组比较差异有统计学意义(P＜0.05)；第7甲基化位点（Cs）在对照组存在甲基化状态，在染毒组中出现较为明显的去甲基化现象；第16甲基化位点在对照组呈现无甲基化状态，而随着染毒剂量增加，在染毒组中出现较为明显的甲基化现象。结论：根据以上结果结合讨论可得出如下结论:1.青春期前BPA较高浓度短期暴露可能对卵巢卵泡的发育和性激素分泌功能具有抑制毒效应，主要表现为卵巢重量及卵巢脏器系数下降、卵泡总数下降、生长卵泡构成比下降及闭锁卵泡构成比升高、卵泡凋亡率升高、血清孕激素水平下降。2.促进卵泡发育的Kitlg基因、Figla基因、H1foo基因表达水平下调以及抑制卵泡发育的AMH基因表达上调，可能在青春期前BPA暴露抑制卵巢发育过程中发挥了重要作用。3. DNA甲基化模式的改变在Kitlg、Figla、H1foo及AMH等基因表达调控中的可能作用值得我们重视；Kitlg基因表达下调可能与其启动子区CpG岛甲基化模式的改变有关。