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16α,17α-环氧-11a-羟基黄体酮(HEP)是一种重要的医药中间体,可广泛应用于氢化可松、强的松等甾体激素类药物的合成。在工业中,常使用16a,17a-环氧黄体酮(EP)作为底物,通过黑根霉等真菌生物催化转化获得HEP。在此过程中,NADPH作为细胞色素P450酶的氢供体参与EP的羟基化。因此,提高NADPH的代谢强度对促进HEP的合成具有极其重要的作用。本研究通过在黑根霉中克隆表达米根霉G6PDH基因,增加辅酶NADPH的产量,提高黑根霉对EP的生物转化率。论文首先从米根霉中通过反转录获得其G6PDH的cDNA序列,从pAN7-1中通过PCR扩增获得启动子PgpdA和终止子TtrpC序列;并与具有潮霉素B抗性基因的真菌表达载体pCB1004连接,构建重组pCB1004-G6PDH表达载体。其次,探究黑根霉原生质体的形成条件,通过原生质体转化法将pCB1004-G6PDH导入黑根霉。黑根霉细胞壁的最佳酶解条件为:30℃下,75 μg/mL Yatalase 和 50 μg/mL Lywallzyme 处理 6 h;原生质体稳定存在的渗透压稳定剂为0.6 mol/LMgS04·7H2O。黑根霉对潮霉素B敏感性实验显示,潮霉素B对黑根霉的最低抑制浓度为250 μg/mL。pCB1004-G6PDH导入黑根霉原生质体,抗性筛选获得基因工程菌。EP发酵结果显示,基因工程菌EP的生物转化率比原始菌增长10.08%。同时,分析黑根霉EP发酵曲线,工程菌达到最高生物转化率的时间比原始菌提前4 h。进一步分析NADPH的含量,工程菌菌体内NADPH的含量为原始菌的1.90倍。然后,通过响应面(RSM)优化法考察黑根霉工程菌的发酵条件,确立了 50 mL发酵体系的最佳培养基成分(g/L):葡萄糖36.00,蚕蛹粉 14.00,玉米浆粉 22.60,(NH4)2S04 0.80,KH2P04 3.00,pH 4.60。发酵52 h后检测,黑根霉工程菌EP的生物转化率比优化前增长3.58%。最后,通过分批补糖发酵,考察黑根霉工程菌在50 mL发酵体系中最佳的补糖量及补糖时间。分析黑根霉工程菌发酵曲线,确定以30.00 g/L葡萄糖为初始发酵糖浓度。20 h和36 h分别补加12.00 g/L葡萄糖,得到最高的EP生物转化率为38.75%,比原始菌增长17.28%。