microRNA(miRNA)作为一类长度在21-24 nucleotide(nt)的非编码RNA,在植物的生长发育,形态建成,激素信号转导,逆境胁迫响应方面起着重要的作用。目前,miRNA在棉花领域的研究不多,特别是在棉花纤维发育的功能研究几乎没有,而棉花纤维这种单细胞类型是研究细胞伸长和细胞壁合成的良好模型。故我们利用小RNA测序和降解组测序的手段,鉴定了一批在棉花纤维中表达的miRNAs和大量的miRNA靶标基因,并且我们利用转基因手段对mi RNA157及其靶标在纤维发育和调控花器官大小的功能做了一定的阐述。具体结果简述如下:1.纤维发育相关microRNAs的挖掘与鉴定我们构建了七个纤维发育文库,覆盖纤维的起始,伸长和次生壁加厚期。七个文库一共检测到了78万到209万条序列,注释到47个保守miRNA家族,同时预测了34条保守miRNA前体。此外,还鉴定了七个新的候选miRNAs。这些小RNA的长度主要集中在21nt到24nt之间,miRNA的5’首位碱基更偏好为尿嘧啶。聚类分析和Northern blot的结果显示大部分的mi RNAs在纤维发育的不同时期变化非常剧烈。转基因和组织化学染色的方法进一步证明miR156/157,miR165/166和mi R172在纤维和胚珠中具有生物活性。2.miRNA靶标基因调控纤维发育网络的挖掘和鉴定利用降解组测序的手段,共有140个保守miRNAs靶标和38个新的候选miRNAs靶标被检测到。这些保守靶标中有很多是转录因子,还有一些跟生长素信号,钙离子信号,双氧水信号相关。另外还发现许多靶标和细胞壁、细胞骨架相关或者是能量代谢相关。RLM-RACE技术也证实了microRNA的确能够诱导靶标基因转录本被剪切降解,证明降解组测序的结果是可靠的。我们挑选了七个感兴趣的靶标,分析了靶标和对应miRNAs表达模式的负相关性,据此推测Gb-miR156/157,390,399可能通过参与到信号转导、转录调控来影响纤维发育,而Gb-miR159,164,167和nmiR3可能直接调控细胞骨架的合成、细胞壁的合成与修饰,以及能量代谢来调控纤维的发育。3.miRNA157可能正调控纤维伸长分析野生种和驯化种棉花差异表达基因,发现miR157的靶标SBP转录因子表达水平在棉花野生种纤维细胞整体上要高于驯化种,而Gb-miR157相反地在驯化种中表达量更高。通过转基因手段,降低miR157在纤维细胞的活性,可以提高miR157靶标SBP转录因子的表达量,而转基因材料的纤维长度则变短。由此推测,SBP转录因子可能抑制纤维细胞的发育。推测棉花驯化过程中,通过提高miR157的表达量来间接抑制SBP转录因子,最终达到促进纤维伸长的目的。4.miRNA157参与调控花器官的发育Real-time PCR和Northern blot结果显示miR157的表达量的确在超量表达miRNA157转基因材料中显著提高了,但是转基因材料的纤维长度并没有如预期的变长。转基因材料植株营养生长特别旺盛,叶枝明显增多,而花器官相反却明显变小,子房内胚珠数目明显减少,导致最终棉桃成熟的种子数目减少,收获的单铃籽棉产量显著降低。利用RLM-RACE技术技术在棉花花蕾中鉴定了miR157的靶标基因,它们是5个SBP-like(SPL)转录因子。利用RNA sequencing技术,我们也发现这5个SPLs基因的表达量在超量表达植株里面下调表达,进一步证明miRNA157可能通过负调控这5个SPLs基因来影响花器官的发育。另外,RNA sequencing测序的结果显示和花器官发育相关的两个MADS-box基因,AtAGL6和SITDR8的同源基因也下调表达。把检测生长素信号的DR5::GUS报告基因通过杂交的方式导入到超量表达miR157转基因材料后,发现转基因材料的生长素信号和阴性对照相比明显减弱。这些结果说明,miRNA157可能通过靶标基因SPLs激活MADS-box基因和生长素信号的转导来调控花器官的大小和胚珠的形成。