论文部分内容阅读
MicroRNA(MiRNA)是一类19-25nt的单链非编码微小RNA,广泛存在于从病毒、线虫到动植物的细胞中,在转录后水平通过抑制翻译或裂解靶基因mRNA来负性调控靶基因的表达。已证实miRNA参与了包括发育、病毒防御、造血过程、器官形成、细胞增殖和凋亡、脂肪代谢等多种调节途径。研究发现,除动植物细胞能编码miRNA外,许多病毒也编码了-niRNA。MiRNA注册数据库miRBase第19版已经收录了病毒来源的436个miRNAs分子,但这些病毒来源的miRNA绝大多数是DNA病毒所编码,RNA病毒来源的miRNA屈指可数。目前,仅在逆转录RNA病毒中的人免疫缺陷病毒(HIV)、牛白血病病毒(BLV)和非逆转录RNA病毒中的西尼罗河病毒(WNV)三种RNA病毒中发现病毒来源的miRNA,其他RNA病毒,特别是细胞质复制的RNA病毒编码的miRNA至今未见报道。甲型肝炎病毒(Hepatitis A virus)类属小核糖核酸病毒科肝病毒属,是一种典型的细胞质复制RNA病毒,其基因组为单股正链RNA。HAV在体外细胞培养中生长缓慢、复制周期长、复制效率低、不引起细胞病变,并形成持续性感染。这些独特的特征提示,该类病毒极有可能像西尼罗河病毒一样编码功能性的miRNA来调控病毒在细胞中的复制和增殖。本研究以细胞质复制的单股正链RNA病毒甲型肝炎病毒(HAV)H2毒株为研究对象,分析其编码miRNA的可能性,并对其编码的miRNA进行预测和鉴定,同时探索其编码miRNA的生物学途径和所编码miRNA的潜在生物学功能。首先,我们利用VMir软件和RNAstructure5.3软件在HAV基因组RNA中发现4个潜在的pre-miRNAs茎环结构,分别为MD59、MD62、MD80和MD92,在负链RNA中发现有3个潜在的pre-miRNAs茎环结构,分别为MR37、MR49和MR62。利用同源片段搜索法预测pre-miRNA剪切后产生的成熟miRNA,结果显示,这7个pre-miRNAs茎环结构剪切后可能产生28种成熟的miRNAs序列。其次,我们对生物信息学预测的miRNAs分子进行实验验证和生物学特征鉴定。首先通过stem-loop RT-PCR法证实了9个预测的成熟miRNAs在HAV感染的KMB17细胞中表达,我们将其作为候选miRNA并分别命名为：hav-miR-N1-5p、 hav-miR-N1-3p、hav-miR-D1-5p、hav-miR-D2-5p、hav-miR-N2-3p、hav-miR-D3a、 hav-miR-D3b、hav-miR-D4-3p、hav-miR-D4-5p。同时对这9个候选niRNAs进行基于RT-PCR的miRNA cDNA克隆及测序分析,结果显示,9个候选miRNAs被扩增序列与预测的序列完全一致,进一步证明了这9个候选miRNAs在HAV感染的细胞中的确被表达。在获得HAV来源的9个miRNAs序列后,我们对它们在细胞中的表达进行了poly (A)-tailed RT-PCR检测,结果显示9个miRNAs都能被特异性扩增。为了确定被克隆的miRNAs与预测的pre-miRNAs在结构上的剪切关系,我们构建了miRNA表达质粒pcDNATM6.2-GW/EmGFP-HAV-miRNA,质粒转染KMB17细胞和293T细胞后,预测的7个pre-miRNAs表达出9个成熟的miRNAs,从而证明了被克隆的成熟miRNAs是由预测的pre-miRNAs茎环结构剪切而来。为了确定HAV编码miRNA的生物学途径,我们利用RNAi技术分别下调经典miRNA合成途径中的Drosha酶、Dicer酶、Exportin-5转运蛋白和AG02蛋白的表达,并检测四个蛋白的表达被分别下调后HAV编码miRNAs水平的变化,结果证实HAV编码miRNAs的过程是一个依赖Drosha酶、Dicer酶和AG02蛋白,而不依赖Exportin-5转运蛋白的过程。为了确定候选的miRNAs是否具有典型miRNA所具有的PTGS (Post-transcriptional Gene Silencing)活性特征,我们利用双荧光素酶报告基因系统分析了9个候选miRNAs的PTGS功能活性特征,实验结果表明：除hav-miR-N1-3p无PTGS活性特征外,其余8个是真正的具有PTGS功能活性特征的miRNAs分子。时序性表达分析表明,HAV编码的8个miRNAs在病毒感染细胞后的4-8小时表达达到高峰,随后维持在一个较低的水平。再次,我们研究了HAV编码的miRNA对病毒复制增殖的调控作用及作用的分子机制。靶基因预测显示,HAV编码的miRNAs与病毒基因组RNA或负链RNA的相应区段完全互补。双荧光素酶报告基因实验证实HAV编码的miRNA对预测的靶基因具有强烈的表达抑制作用。在HAV与KMB17细胞互作系统中,利用"gain of function"和"loss of function"的功能研究策略,通过miRNA mimic和miRNA inhibitor上调和下调病毒感染细胞中miRNA的表达水平,在HAV亚基因组水平和基因组水平证实了HAV编码的miRNA对病毒复制的抑制作用,并揭示了这种抑制作用的分子机制：miRNA以siRNA的作用方式顺式裂解病毒的基因组RNA或负链RNA,通过病毒的这种自我靶向作用来抑制病毒基因组的复制,进而达到抑制病毒自身复制增殖的目的。本项研究工作证实了一类新的由小RNA病毒编码的miRNA分子,并描述了一种RNA病毒来源的miRNA非经典的细胞质加工途径,同时也揭示了一种由miRNA介导的小RNA病毒在细胞中复制增殖调控的新机制。