瑞特综合征(Rett syndrome,RTT)是一种严重影响儿童精神运动发育的疾病,主要发生在女孩身上(绝大多数男性胚胎致死)。MECP2基因突变是导致RTT的直接原因(约70%的RTT病人MECP2基因发生突变,而MECP2突变90%会导致RTT),由于缺乏理想的动物模型,目前尚没有有效治疗RTT的办法。该基因突变方式80%为单个核苷酸C→T的改变。已经鉴定出了数百个引起RTT的MECP2突变,其中8个热点突变占60%以上,以T158M点突变为首。之前已经通过Cre-loxp技术产生了缺乏MECP2的小鼠,但是不能很好地模拟病人的行为学运动以及啮齿类与人类在大脑结构及遗传背景不是很相似,所以利用非人灵长类(如食蟹猴和猕猴)构建RTT疾病动物模型显得尤为重要。我们实验室在2014年最早报道了利用靶向基因编辑方法TALEN成功编辑MECP2基因的猴模型,现有模型研究发现,灵长类模型更加接近临床疾病表型,可有效模拟社交障碍、刻板行为、大脑发育异常等难以在啮齿类模型获得的表型数据。然而,基于TALEN技术获得的模型有多种类型突变嵌合存在、突变率较低等不足,因此获得单一定点突变类型灵长类动物模型有望避免这些问题。本研究利用BE系统,以临床热点突变T158M为靶点,在细胞和小鼠胚胎水平验证和筛选最优的编辑方案,并在灵长类动物胚胎水平进行了测试,获得了有效的编辑方案,为建立RTT单一热点突变猴模型奠定了基础。研究结果如下:1.sgRNA的设计及细胞水平的筛选首先选取MECP2基因3号外显子的T158M作为靶标,针对该位点利用软件设计3对sg RNA寡聚核苷酸链,将3对sg RNA分别连接到PGL3-U6-puro质粒上,通过测序分析并成功获得构建好的sg RNA质粒。紧接着选取了商业化的293T细胞,采用脂质体转染的方法将sg RNA质粒和BE质粒一起共转进293T细胞中,通过观察荧光率和对细胞的基因组进行sanger测序筛选出了有效的sg RNA,它成功的实现了MECP2基因3号外显子T158M位点上C→T的突变,有效的sg RNA序列为Target-1。2.体外转录质量控制及小鼠胚胎浓度组合优化利用T7体外转录试剂盒转录sgRNA、BE3和BE4max,之后回收sg RNA、BE3和BE4max获得的m RNA。将其稀释至所需浓度进行显微注射,体外培养到早期胚胎。观察BE编辑效率和对胚胎囊胚发育率的影响。先利用猕猴胚胎检测出体外转录m RNA质量出现问题,并成功解决该问题。通过对体外转录进行质量控制后,利用小鼠胚胎设计了4个浓度组合(BE4max-P2A-GFP:T158M-sg RNA=20:10、50:20、100:50和200:100),进行了3次重复实验,当采用BE4max-P2A-GFP:T158M-sg RNA=100:50的组合注射胚胎时,小鼠胚胎囊胚率和编辑效率最佳。3.猕猴胚胎发育及编辑情况统计利用显微操作技术将100:50的浓度组合打入猕猴胚胎中,分析了基因编辑的胚胎囊胚率及编辑效率,发现胚胎的突变率:纯合突变占12.80%,嵌合体突变占18.00%,野生型占69.20%。上述结果显示,我们在小鼠及猕猴胚胎上实现了MECP2基因158位点C→T的转变,为后期建立T158M突变的RTT动物模型建立了稳定的胚胎编辑体系。