酶解蓝圆鲹蛋白制备降血压肽的研究

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蓝圆鰺作为一种低值海洋鱼类,由于缺少有效的加工方法而大都被加工成饲料,休闲食品等,导致产品附加值低,蛋白质资源没有充分利用。本文以蓝圆鰺鱼肉蛋白为原料,选用6种蛋白酶在各自适宜的条件下酶解蓝圆鰺蛋白制备蓝圆鰺降血压肽,并用超滤、凝胶过滤色谱及离子交换层析对酶解产物中活性组分进行分离纯化,为开发新的生物活性肽,提高蓝圆鰺蛋白质的利用率以及为蓝圆鰺的深加工提供理论依据。对蓝圆鰺蛋白进行了蛋白含量测定及氨基酸分析,结果显示蓝圆鰺蛋白质含量为79.98%(干基),18种氨基酸总量达850.39mg·g-1,其中8种必需氨基酸占总量的46.28%,芳香族氨基酸占含总量的11.35%,非极性氨基酸占总含量的35.07%。比较了六种蛋白酶酶解蓝圆鰺鱼肉蛋白的酶解产物对血管紧张素转化酶(ACE)的抑制活性,其中木瓜蛋白酶酶解产物对ACE的抑制活性最大,其IC50(对ACE抑制率为50%所需的酶解产物的浓度)为33.3μg·mL-1。考察了木瓜蛋白酶酶解蓝圆鰺鱼肉蛋白水解度与抑制率的关系,确定水解度在13.0%~16.0%之间酶解产物具有较好的ACE抑制活性,酶解产物对ACE抑制活性最高可达67.4%。通过单因素试验考察了影响水解度的有关因素,确定了适宜的水解条件为:初始酶用量7000U·百1Pro,初始底物浓度2.5%,酶解温度45℃,pH7.0,酶解时间为240min,此时水解度为16.0%,酶解产物对ACE具有较好的抑制活性,经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳发现酶解产物的分子量主要在14.4KDa以下。依据酶促反应机理得到了酶解的动力学模型公式,并且根据木瓜蛋白酶酶解蓝圆鰺蛋白的结果得到木瓜蛋白酶酶解蓝圆鰺蛋白的动力学模型R=(202.785e0+0.896S0)exp[-0.6513(DH)]和同时得到水解反应中木瓜蛋白酶失活常数Kd为112.33min-’,水解活化能△EA为33.85KJ-mol-1,酶失活活化能AED为38.49KJ·mol-1。最后对水解动力学模型进行验证,发现理论结果与实际结果相符合。采用10KDa和5KDa的超滤膜对酶解产物进行超滤,得出最优的超滤条件为:10KDa膜的超滤时间为80min,超滤温度为30℃,pH为7.0,料液浓度为22.4mg·L-1;5KDa膜的超滤时间为80min,超滤温度为30℃,pH为7.0,料液浓度为22.4mg·L’。同时比较了超滤前后不同组分的ACE抑制率,其中酶解液的抑制率为51.26%,10KDa渗透液的ACE抑制率为62.71%,5KDa渗透液的ACE抑制率为88.47%,说明超滤能有效地初步分离具有降血压活性的组分。采用凝胶过滤色谱和离子交换层析分离纯化分子量小于5KDa的蓝圆鰺蛋白酶解产物。经过凝胶色谱确定了凝胶Sephadex G-15分离蓝圆鰺降血压肽的最佳的分离条件为:采用超纯水作为洗脱剂,上样蓝圆鰺肽蛋白体积为1mL,洗脱流速为0.8mL·min-1,样品蛋白浓度为10.2mg·mL-1。在该条件下分离出的四个组分均有抑制活性,G3#抑制活性最高,为56.38%,实现了分离的目的。采用Mono Q4.6/100预装柱分离蓝圆鰺降血压肽,在缓冲液pH7.0,离子强度为10mM的较优分离条件下分离出的三个组分对ACE的抑制率均较大,分别为穿透峰92.95%,洗脱峰I1#95.71%,洗脱峰I2#96.23%,且该条件下分离出的多肽活性总回收率为86.85%,蛋白质总回收率为64.85%。
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