由于具有羟基和羧基两个功能基团,手性羟基酸在化工、医药和农药领域具有重要应用价值。例如,(R)-2-羟基-邻氯苯乙酸是治疗心血管疾病畅销药物氯毗格雷的重要手性前体,(R)-2-羟基-4-苯基丁酸可用于合成多种血管紧张素转化酶抑制剂(ACEI)。本实验室在前期工作中通过传统土壤筛选的方法得到一株恶臭假单胞菌Pseudomonas putidaECU1011,能够高选择性地催化水解(S)-2-乙酰氧基-苯乙酸,实现外消旋2-乙酰氧基-苯乙酸及其衍生物的拆分。在此基础上,本课题通过基因组狩猎法挖掘得到相应的能够催化2-乙酰氧基-苯乙酸对映选择性水解(脱乙酰化)的酯酶,并从催化剂形式、底物类型以及反应器操作方式等多个角度对其催化的拆分反应进行了系统研究。最终构建了一种高效、通用、绿色的手性羟基酸生产工艺。论文主要包括以下几部分工作：第一部分,目标酯酶的筛选及基本性质表征。根据Pseudomonas putida ECU1011进化树及NCBI数据库公布的恶臭假单胞菌基因组信息预测候选酯水解酶16个,并在E.coli BL21(DE3)中表达。以外消旋2-乙酰氧基苯乙酸为目标底物,对成功克隆表达的9个酯水解酶进行筛选,得到能选择性水解(S)-底物的酯酶rPPE01。rPPE01能够选择性水解一系列乙酰化的α-羟基酸,且表现出非常出色的对映选择性(E>200),而对乙酰化的β-羟基酸没有催化活性。进一步对该酶的基本性质进行表征,其反应最适pH为6.2,最适温度为50℃。令人惊喜的是,rPPE01还表现出了良好的热稳定性和有机溶剂耐受性,而酶的稳定性和有机溶剂耐受性是影响其工业化应用的关键因素。以上性质表明rPPE01在α-羟基酸拆分中表现出良好的应用潜力,不过其催化活性和操作稳定性有待于进一步的提高。第二部分,rPPE01的蛋白质工程改造。针对其催化活性低的问题,通过半理性设计的方法在分子水平对rPPE01进行改造。基于同源建模及分子对接结果,寻找可能影响底物和酶结合或催化速率的残基,设计并构建可能提高活性的突变体。动力学参数测定表明,最好的突变体W187H对2-乙酰氧基邻氯苯乙酸的催化效率(kcat/KM)提高了101倍,且保持了和母本同样出色的对映选择性(E>200)。底物谱研究表明,rPPE01W187H对于大部分α-乙酰化羟基酸催化活力提高十倍以上,对于β-乙酰化羟基酸没有催化活性。以0.5g/L的冻干细胞上载量对300mM2-乙酰氧基苯乙酸进行拆分反应,在3h时rPPE01W187H催化的反应转化率达到49.7%,而同样时间时母本催化的反应转化率仅为4.4%。第三部分,乙酰羟基酸水解拆分反应中底物形式的考察。与2-乙酰氧基邻氯苯乙酸相比,2-乙酰氧基邻氯苯乙酸甲酯与酶的结合能力增强(KM降低7倍),但kcat降低250倍。因此未被酯化的2-乙酰氧基邻氯苯乙酸更适合作为拆分底物。考虑到其以盐的形式存在于反应体系,接下来对底物的阳离子进行优化,发现钾离子对酶的保护作用明显优于其他阳离子,在拆分高底物浓度(500mM)的反应中,15h时反应转化率接近最大理论转化率(500%),而在钠盐和铵盐体系中即使延长反应时间至20h,转化率分别为39%和9.4%。在优化条件下,对一系列重要光学纯羟基酸(2-羟基-3-苯丙酸、2-羟基-苯乙酸及其衍生物)进行制备,均取得满意拆分效果。第四部分,酯酶rPPE01W187H的固定化。通过比活力和稳定性的筛选,我们选择具有亲水骨架和伯氨基功能基团的商品化树脂ESR-1作为固定化载体。经过条件优化,固定化过程中活力回收率可达60%,得到的固定化酶比活约为90U/g。rPPE01W187H@ESR-1表现出明显优于游离酶的热稳定性,其在30。C保温1440h没有明显的失活,而同样温度下游离酶的半衰期仅为50.2h。固定化的rPPE01Wi87H@ESR-1在2-乙酰氧基邻氯苯乙酸拆分反应中可重复使用22批次(253h),显著提高了酶的操作稳定性,并可实现重复利用。第五部分,固定化酶的连续反应。通过固定化方便地实现了酶的重复利用,但是利用搅拌罐式反应器进行重复批次反应,存在固定化颗粒容易被打碎,批次之间需要增加分离、投料等辅助操作时间的问题。因此,我们构建了填充床反应器进行连续化反应,并对初始pH、物料流向、反应器高径比等重要参数进行了优化。最终在2-乙酰氧基邻氯苯乙酸的拆分反应中,固定化酶填充床反应器的时空产率高达140g L-1h-1(3.36kgL-1d-1)。进一步对固定化酶在填充床反应器的操作稳定性进行考察,在100mM底物浓度下连续反应42天没有明显的活力损失。