【摘 要】
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目的模拟骨组织组成和结构的仿生矿化是组织工程技术研究的热点之一。本研究中,牙本质非胶原蛋白(DNCPs)被提取作为生长因子;同时烧结牙齿制备出牙源性双相磷酸钙(BCP)作为骨修复材料,并将蛋白负载到支架上。体外实验验证材料和蛋白的生物相容性,并在兔上颌窦提升术模型中,评价DNCPs联合牙源性BCP应用在上颌窦提升术中,对窦底提升后骨重建中的体积维持,新骨生成量及新生骨质量的影响。方法依次将牙本质粉
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目的模拟骨组织组成和结构的仿生矿化是组织工程技术研究的热点之一。本研究中,牙本质非胶原蛋白(DNCPs)被提取作为生长因子;同时烧结牙齿制备出牙源性双相磷酸钙(BCP)作为骨修复材料,并将蛋白负载到支架上。体外实验验证材料和蛋白的生物相容性,并在兔上颌窦提升术模型中,评价DNCPs联合牙源性BCP应用在上颌窦提升术中,对窦底提升后骨重建中的体积维持,新骨生成量及新生骨质量的影响。方法依次将牙本质粉末置于含有蛋白酶抑制剂的盐酸胍,EDTA,盐酸胍中,提取出DNCPs,透析后冻干。并通过考马斯亮蓝染色和Western blot鉴定其成分。支架材料方面,将离体牙置于烧结炉中煅烧,制备出BCP。通过X线衍射(XRD),元素分析和BET检测其物相,组成,比表面积,孔隙容积,孔径等,并扫描电镜下观察材料表面。再将细胞分别接种于材料和负载了蛋白的材料上,与临床常用的BioOss(DBBM)和β-TCP材料作对比,检测细胞黏附率,增殖活力,黏附细胞形态,细胞骨架及铺展状况。动物实验选用新西兰白兔,行上颌窦提升术,分别填入BCP,DBBM和β-TCP骨粉,通过Micro-CT和不脱钙硬组织切片评价蛋白和材料的联合应用在上颌窦环境下的成骨能力。结果考马斯蓝染色结果表明,DNCPs复合物的分子量主要分布在70 k Da,55 k Da,130 k Da及180 k Da左右。Western blot结果显示,DNCPs提取物中含有并表达DSPP、DMP1、OPN和BMP2。牙源性BCP检测的物相为羟基磷灰石(HA)和β-磷酸三钙(β-TCP),(HA/β-TCP:71/29),钙磷元素比为1.627。虽然BCP的比表面积最小,但其平均孔径最大,有很多200nm的孔存在。此外,材料具有1 nm左右的微孔。扫描电镜结果显示,BCP上有牙本质小管开口样的交通孔隙,以及1μm左右的颗粒样结构。体外实验显示,DNCPs对细胞粘附和增殖无明显影响。β-TCP材料上的细胞粘附率和增殖能力要高于BCP和DBBM。接种后1天,材料上的细胞呈梭形或椭圆形,有细长的丝状伪足伸出,部分细胞已开始铺展。接种后3天,细胞铺展面积增大,形态正常,增殖明显。Micro-CT结果显示,β-TCP组窦提升组织体积(TV)明显低于DBBM组和BCP组(P<0.05),BCP-DNCPs组骨体积分数(BV/TV)显著高于BCP-Control和β-TCP-DNCPs组。骨密度(BMD),骨小梁数(Tb.N)等指标在各组间无显著差异(P>0.05),而BCP材料组和DNCPs亚组的骨小梁分离度(Tb.Sp)明显更小(P<0.05),提示其骨质量更高。组织学分析也显示,β-TCP材料不能维持上颌窦骨提升的空间,BCP-Control和DBBM-Control组的新骨区域面积比均大于β-TCP-Control组,差异有显著性(P<0.05)。而且在三种材料的Control亚组与DNCPs亚组之间都发现了绿色区域平均积分光密度(IOD)值的显著差异(P<0.05),表明DNCPs可能促进骨基质矿化。结论DNCPs与牙源性BCP在上颌窦提升术中的联合应用,可以很好地维持窦底提升后的骨重建体积,促进新骨形成并提高新生骨质量。
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