钝顶节旋藻螺旋手性差异藻丝的部分生化特性与功能基因比较

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手性与生物的起源、进化、生长发育、生殖、生产性状等密切相关,是当前国内外的研究热点之一。节旋藻是一种由多个细胞串连而成的原核丝状蓝藻,具有典型、简单、互变的手性特征,是开展生物手性研究的理想材料。节旋藻的手性及其取向在某些条件下会发生逆变,甚至完全丧失变直呈手中性。众多研究与生产实践表明,节旋藻的螺旋手性一旦丧失变为手中性,就意谓着种质退化而严重影响生产。到目前为止,有关节旋藻螺旋手性在分子层面上的差异研究,大多集中于蛋白水平,而在基因水平上却鲜有报道,且尚未见有关节旋藻螺旋手性取向逆变对生产是否有影响的研究。因此,本论文首次利用节旋藻在工厂化培植生产中藻丝易发生多形性变异的特性,构建了14种手性等形态特征存有显著性差异的藻丝群体,进而对它们的部分生化特性及功能基因作了比较研究。本研究为揭示节旋藻螺旋手性形成与调控的分子机制及生产上防治良种退化等生产实际问题提供了新的信息与技术方法。主要结果如下:  1、钝顶节旋藻螺旋手性差异藻丝的构建  依据钝顶节旋藻显微形态和生理生态特征差异,利用毛细管显微操作技术等分离方法,从经工厂化培植后的本征手性为左手性的钝顶节旋藻品系CHM中分离并纯化出14种在螺旋手性及其取向、藻丝长、螺旋数或螺距等形态学参数具显著性差异、且在实验室继代培养320 d的过程中一直保持稳定的藻丝群体。其中,呈左手螺旋的有4种,记为CHM-1~4;呈右手螺旋的有9种,记为CHM-5~13;呈手中性的1种,记为CHM-14。基于16S rRNA及ITS序列的分子生物学鉴定结果显示:CHM-1~14及其出发株CHM的16S rRNA序列完全一致;ITS序列,仍有14种藻丝群体的序列完全一致,但CHM-5的则在459位出现了一个差异位点,由A变为C。上述结果表明,钝顶节旋藻品系CHM在大规模培植中不仅螺旋手性及取向、藻丝长度等形态特征会发生显著变化,其DNA序列也会发生变化,且这些形态学特征的某些变化,可能源于DNA的突变。  2、钝顶节旋藻螺旋手性差异藻丝的部分生理生化特性比较  对CHM-1~14及其出发株CHM的生长速率、光合色素含量、氨基酸组成及含量和蛋白质含量等作了比较,结果未发现三类手性差异藻丝间的上述生理生化指标存有明显的共性差异,但藻丝的本征手性取向逆变为右手螺旋后,其生长速率和光合色素含量的总体变化量明显下降,分别约低15.1%和11.7%。这说明节旋藻藻丝螺旋手性本征取向逆转会影响生产。手中性藻丝CHM-14生长速率和光合色素含量虽没有明显下降,但也会因变直而带来难以过滤采收等生产实际问题。上述结果进一步表明藻丝的螺旋手性及其本征取向是节旋藻重要的生产性状之一。  3、钝顶节旋藻螺旋手性差异藻丝的部分功能基因比较  以CHM-1~14及其出发株CHM为材料,对手性差异藻丝间可能与螺旋手性相关的细胞骨架蛋白基因mreB和ftsZ及藻胆蛋白相关基因apc、pc和cpcHID的序列进行了克隆并作了比较分析。结果表明:被纯化的14种差异藻丝CHM-1~14除mreB序列未发生变化外,其它4个功能基因均发生了不同程度的变化;藻丝最长的CHM-3的突变率最高,达7.4‰。其中,(1)CHM-1~14及其出发株CHM的ftsZ序列,有12种藻丝的完全一致,而逆变呈右手螺旋的CHM-5、7和11的ftsZ序列在57、113和120位与上述12种藻丝的有3个共性差异位点,氨基酸序列有1个共性差异位点,蛋白质的二级结构亦发生显著变化。据此推测,ftsZ这3个位点的变异可能是导致节旋藻藻丝螺旋手性逆变的主要原因之一。(2)apc序列,有13种藻丝的完全一致,右手螺旋藻丝CHM-9及手中性藻丝CHM-14的apc序列与上述13种藻丝的存在1个共性差异位点,但氨基酸序列未发生变化。(3)pc序列,有14种藻丝完全一致,藻丝最长的CHM-3的则与上述序列在β亚基基因上有22个差异位点。(4)cpcHID操纵子序列,除CHM-1和CHM-3的发生变异外,其它13种藻丝完全一致。其中,CHM-1的有4个差异位点;CHM-3的有27个差异位点。上述结果虽未能在分子水平显现节旋藻手性逆变的共性调控规律,但至少提示ftsZ很可能是节旋藻藻丝螺旋手性的主要调控基因之一,并从节旋藻在大规模生产中形态及基因多变性的事实,提示了建立高通量分子辅助育种与筛检等技术的重要性。
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