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第一部分:人脐带华通氏胶间充质干细胞的生物学特性及其向肌源性细胞分化的实验研究研究目的研究人脐带华通氏胶间充质干细胞(human umbilical cord Wharton’s Jelly mesenchymal stem cells,hUCMSCs)的生物学特性及其向肌源性细胞分化的能力,并进行携带绿色荧光蛋白(greenfluorescentprotein,GFP)基因的慢病毒转染以获得稳定表达GFP报告基因的hUCMSCs。研究方法收集新鲜健康足月产胎儿脐带组织,将其放置于l×磷酸盐缓冲液(phosphate buffered saline,PBS)溶液中反复冲洗,并清除脐带内的血管,留下华通氏胶组织。将其剪成lmm3大小的组织块,采用II型胶原酶消化法从华通氏胶中分离得到hUCMSCs进行原代细胞培养,约10d后细胞达80%-90%的汇合度时传代培养,并观察其细胞形态。取第3代对数生长期细胞,应用流式细胞术(fluorescence activated cell sorting,FACS)检测hUCMSCs免疫表型;应用免疫荧光检测多潜能干细胞标记物Sox2、Oct4和Nanog的表达;并在体外应用5-氮杂胞苷(5-azacytidine,5-Aza)诱导其向肌源性细胞分化,用免疫荧光检测骨骼肌干细胞标记物Pax-7和MyoD的表达;用携带GFP基因的慢病毒转染hUCMSCs,应用FACS分析其转染率。研究结果采用II型胶原酶消化法获得可贴壁生长的大量hUCMSCs,其能在体外被成功地进行扩增培养,原代培养hUCMSCs表现为上皮细胞样或短成纤维细胞样外,传代后的hUCMSCs均表现为典型的长纺锤样或成纤维样细胞的形态。FACS结果显示,hUCMSCs可高表达间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)标记物CD29、CD44、CD73、CD90和CD105,而极低表达造血系标记物CD14、CD34、CD45和HLA-II。免疫荧光染色结果显示hUCMSCs能表达多潜能干细胞标记物Oct4和Sox2,但未见Nanog的表达。且在体外5-Aza诱导条件下表达骨骼肌干细胞标记物Pax-7和MyoD。携带GFP基因的慢病毒转染后,hUCMSCs可以稳定表达GFP,FACS分析显示转染率可达到50-70%,可获得大量稳定表达GFP基因的hUCMSCs。研究结论本研究证实了人脐带华通氏胶中存在MSCs,且其具有向肌源性细胞分化的潜能。利用慢病毒转染能获得稳定表达GFP的hUCMSCs,从而为后期hUCMSCs移植疗效的追踪观察奠定了一定的实验基础。第二部分:人脐带华通氏胶间充质干细胞治疗肌肉衰减综合征的实验研究研究目的采用人脐带华通氏胶间充质干细胞(human umbilical cord Wharton’s Jelly mesenchymal stem cells,hUCMSCs)移植治疗肌肉衰减综合征小鼠,观察其是否有效并探讨相关可能的作用机制。研究方法1.利用后肢悬提(hindlimb suspension,HLS)方法在32只老年雄性C57BL/6J小鼠(24月龄)建立肌肉衰减综合征模型,HLS 2周后,所有的小鼠称重,项部皮下埋入 25mg5-溴-2’-脱氧尿苷(5-bromo-2’-deoxyuridinetablet,BrdU)缓释片后恢复自由行动。2.根据是否接受干细胞移植治疗及移植途径不同将小鼠分为腓肠肌局部肌肉移植hUCMSCs(Muscular Transplant,MT)组、腓肠肌局部肌肉注射 PBS(MT-Con)组、尾静脉移植 hUCMSCs(Tail Vein Transplant,TVT)组、尾静脉注射PBS(TVT-Con)组,每组8只;hUCMSCs组每次给予0.1 ml含l×106个hUCMSCs的l×PBS,PBS组每次给予0.1 ml的l×PBS,移植治疗所用的干细胞为传代至5～6代的GFP标记的hUCMSCs,每周1次,连续8周。3.疗效评价:8周后水合氯醛麻醉,再次称重,即刻分离双侧的腓肠肌并记录湿重。比较hUCMSCs组和PBS组腓肠肌的绝对和经体重标化的相对湿重、肌纤维的横截面积等指标对hUCMSCs移植的疗效进行评价。4.机制探讨:(1)利用荧光显微镜来观察GFP标记的hUCMSCs在腓肠肌内的变化;(2)利用免疫荧光染色的方法分别对表达BrdU、Pax-7的细胞核进行计数并计算它们的表达指数;(3)利用脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法(terminaldeoxynucleotidyl transferase mediated nick end labeling,TUNEL)对凋亡的细胞核进行计数并计算凋亡指数;(4)利用蛋白免疫印迹实验(Westernblot)和酶联免疫吸附实验(enzyme-linked immunosorbnent assay,ELIS A)测定肌肉组织中炎性因子 TNF-α和IL-6,抗炎因子IL-4的表达。5.采用SPSS13.0统计软件进行数据分析,计量资料数据以x±s表示,采用双向方差分析(two-wayANOVA)对不同移植方式(TVTvs.MT)和有无治疗(hUCMSCsvs.PBS)进行比较。采用重复测量数据的方差分析(repeated-measures ANOVA)对 HLS 前和 HLS 后以及 hUCMSCs 治疗后的纵向数据进行分析。以P<0.05为差异有统计学意义。研究结果1.hUCMSCs在肌肉衰减综合征小鼠模型中的作用:HLS导致老年小鼠的体重平均下降13%左右,但与悬吊前相比无显著性差别,四组间小鼠体重的下降也无显著性差异(P>0.05)。hUCMSCs移植8周后,体重仍继续下降,hUCMSCs组小鼠下降小于其相应PBS对照组,但无显著性差异(P>0.05)。hUCMSCs移植显著增加腓肠肌的湿重和肌纤维的横截面积(P<0.01)。相对于TVT组,MT组腓肠肌湿重的增加更为明显(P<0.05)。2.(1)荧光显微镜下未找到GFP标记的hUCMSCs;(2)BrdU、Pax-7的表达指数:hUCMSCs移植可以显著增加腓肠肌肌肉组织中BrdU和Pax-7阳性细胞指数(同对照组相比,MT组P<0.001,TVT组P<0.01),尽管这种增加在MT组更为明显,但同TVT组相比,两组间差别并无显著意义(P>0.05)。3.腓肠肌细胞核的凋亡指数:hUCMSCs移植可以显著减少腓肠肌肌肉组织中凋亡细胞指数(同对照组相比,MT组P<0.001,TVT组P<0.01),尽管这种减少在MT组更为明显,但同TVT组相比,两组间差别并无显著意义(P>0.05)。4.肌肉组织炎性细胞因子和抗炎性细胞因子的含量:不论是TVT组还是MT组,hUCMSCs移植能显著减少HLS后老年C57BL/6J小鼠腓肠肌肌肉组织炎性因子TNF-α和IL-6的表达,增加抗炎因子IL-4的表达。研究结论1.hUCMSCs移植显著改善老年小鼠腓肠肌的湿重及肌纤维的横截面积,hUCMSCs移植能有效治疗肌肉衰减综合征。2.hUCMSCs移植有效治疗肌肉衰减综合征的作用机制可能通过激活骨骼肌卫星细胞、减少细胞核凋亡和减轻慢性炎症反应促进老年骨骼肌纤维的增生。