研究背景:肝癌是我国的高发肿瘤之一,五年生存率低,严重危及人类的健康和生命。研究证实PGE₂可以通过促进肿瘤细胞的增殖、侵袭转移和肿瘤血管形成而促进肿瘤的发生发展。PGE₂通过细胞膜表面的PGE₂受体（EP受体）发挥作用,EP受体为细胞膜G蛋白偶联受体,有4种亚型,分别称为EP1、EP2、EP3和EP4受体。SnoN（ski-related novel gene）是Ski原癌基因家族的成员之一,通过与smads蛋白作用可调节TGF-β-smads信号通路,进而促进肿瘤的生长。目前研究表明,SnoN蛋白在人类许多肿瘤细胞中高表达,但在人肝癌组织中关于SnoN蛋白的报道较少,有关SnoN在PGE₂对人胆管细胞癌CCLP1细胞增殖能力调控中的作用目前还不清楚。本研究应用PGE₂、四种EP受体激动剂、腺苷酸环化酶（AC）激动剂Forskolin、cAMP拟似物dbcAMP及PKA抑制剂H89处理人胆管上皮癌细胞CCLP1,观察其SnoN表达水平的变化及与CCLP1细胞增殖能力变化的关系,意在阐明SnoN蛋白在PGE₂调控CCLP1细胞生长中的作用及其可能的信号转导通路。研究目的:探讨SnoN蛋白在PGE₂调控CCLP1细胞生长中的作用及其可能的信号转导通路。研究方法:1.细胞培养:取人胆管上皮癌细胞株CCLP1按常规方法培养。2.外源PGE₂处理培养的CCLP1细胞后,RT-PCR实验检测其SnoN mRNA表达的变化。3.外源PGE₂处理培养的CCLP1细胞后,Western Blot实验检测细胞胞浆内SnoN蛋白表达的变化。4.外源PGE₂四种EP受体激动剂（EP1:17-phenyltrinor Prostaglandin E₂;EP2:Butaprost;EP3:Sulprostone;EP4:Prostaglandin E1 Alcohol）处理培养的CCLP1细胞后,WST实验检测细胞增殖能力的变化。EP2受体激动剂处理培养的CCLP1细胞后,WST实验检测细胞增殖能力的变化。5. EP受体激动剂（EP1:17-phenyltrinor Prostaglandin E₂;EP2:Butaprost;EP3:Sulprostone; EP4: Prostaglandin E1 Alcohol）处理培养的CCLP1细胞后,Western Blot实验检测细胞胞浆内SnoN蛋白表达的变化。6.设对照组、腺苷酸环化酶（AC）激动剂Forskolin处理组、cAMP拟似物dbcAMP、Forskolin+H89（PKA抑制剂）处理组,用Western Blot实验检测细胞胞浆内SnoN蛋白表达的变化。7.设对照组、PGE₂激动剂Forskolin处理组、Forskolin+H89（PKA抑制剂）处理组,用WST实验分别检测细胞增殖能力的变化。8.设对照组、PGE₂激动剂Forskolin处理组、Forskolin+H89（PKA抑制剂）处理组,用Western Blot实验检测细胞胞浆内CREB蛋白磷酸化水平的变化。研究结果:1.经10μΜPGE₂处理24h后,RT-PCR实验显示实验组SnoN mRNA表达水平与DMSO对照组相比上升了22.5%（P<0.01）,差异具统计学意义（P<0.01）。2.用1μM,5μM,10μM,20μM PGE₂分别处理CCLP1细胞后,Western Blot实验显示细胞浆中SnoN的表达水平上升了13.4%,24.5%,35.6%,23.5%,差异均具统计学意义（P<0.05）。3. 10μM EP1-4四种受体激动剂（EP1:17-phenyltrinor Prostaglandin E₂,EP2: Butaprost,EP3: Sulprostone和EP4: Prostaglandin E1 Alcohol）处理CCLP1细胞24h后,WST实验观察CCLP1细胞增殖能力,结果显示:PGE₂处理组细胞增殖能力较对照组明显上升,其中以EP2受体激动剂的作用最明显,上升了26.5%,差异具有显著性（P<0.05）。用1μM,5μM,10μM,20μM EP2受体激动剂Butaprost处理CCLP1细胞24h后,WST实验检测CCLP1细胞的增殖能力,结果显示:细胞增殖能力分别上升了13.3%,15.4%,16.1%,18.2%,差异具有显著性（P<0.05）。4.以DMSO为对照,实验组用10μM EP1-4四种受体激动剂（EP₁: 17-phenyltrinor Prostaglandin E₂,EP2: Butaprost,EP3: Sulprostone和EP4: Prostaglandin E1 Alcohol）处理CCLP1细胞24h后,Western blot实验观察SnoN蛋白表达水平,用Image-J软件分析电泳条带。结果显示:EP₂受体激动剂组细胞中SnoN蛋白的表达水平与对照组相比上升了64.9%,而EP1,EP₃,EP₄受体激动剂处理组细胞中SnoN蛋白表达量与对照组相比只分别上升了35.6%,29.6%,24.9%,差异均具有显著性（P<0.05）。5.以DMSO为对照,实验组分别用10μM AC激动剂Forskolin、10μM PKA抑制剂H89预处理1h后再加入10μM Forskolin处理24小时,Western blot实验观察SnoN蛋白表达水平,用Image-J软件分析电泳条带。结果显示:Forskolin组细胞中SnoN蛋白的表达水平较对照组上升了25.1%,而H89+Forskolin组较Forskolin组细胞中SnoN蛋白的表达水平下降了9.1%,差异均有显著性（P<0.05）。6.以ddH20为对照,实验组用500μM dbcAMP处理CCLP1细胞24h后,Western blot实验观察SnoN蛋白表达水平,用Image-J软件分析电泳条带。结果显示:SnoN蛋白的表达水平较对照组水平上升了90.1%,差异有显著性（P<0.05）。7.用1μM, 5μM,10μM Forskolin处理CCLP1细胞24小时后,WST实验检测细胞增殖能力,结果显示细胞增殖能力分别上升了2.7%,3.6%,4.4%,用1μM,5μM,10μM,20μM H89处理CCLP1细胞后,细胞增殖能力较对照组分别下降了2.7%,9.1%,27.1%,45.7%,差异均有显著性（P<0.05）。8.以DMSO为对照,实验组分别用10μM AC激动剂Forskolin、10μM PKA抑制剂H89预处理1h后再加入10μM Forskolin处理24小时,Western blot实验观察CREB蛋白的磷酸化水平,用Image-J软件分析电泳条带。结果显示:Forskolin组细胞中CREB蛋白的磷酸化水平较对照组上升了71.3%,而H89+Forskolin组较Forskolin组细胞中CREB蛋白的磷酸化水平下降了14.1%,差异有显著性（P<0.05）。研究结论:1. PGE₂对CCLP1细胞SnoN mRNA、蛋白的表达具有上调作用。2. PGE₂可通过EP2受体激活cAMP-PKA-CREB信号转导通路上调CCLP1细胞SnoN的表达,从而促进CCLP1细胞的增殖。