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上皮间质转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)是指上皮细胞在特定病理生理条件下向间质细胞转化的现象,与机体诸多的病理生理过程紧密相关,如正常组织发育、组织损伤后修复、良恶性肿瘤发生与转移等。呼吸系统中,EMT被证实参与了肺纤维化、慢性阻塞性肺疾病、肺癌等重要慢性疾病的发生发展,是调控与平衡组织重塑、尤其是气道重塑的重要核心事件。如何调控EMT时程、继而干预整个病程进展,已成为多种慢性呼吸系统疾病防治与管理的重要策略。蛋白酶激活受体2(protease-activated receptor 2,PAR2)是G蛋白偶联受体家族的重要成员之一,因其广泛表达于不同类型细胞(如上皮细胞、血管内皮细胞、成纤维细胞、巨噬细胞、造血干细胞、神经胶质细胞等)、参与调控细胞功能而备受关注。PAR2可被包括胰蛋白酶、类胰蛋白酶、凝血因子VIIa/Xa在内的多种内/外源性丝氨酸蛋白酶激活,参与如炎症、组织损伤与纤维化、疼痛及细胞瘤化等不同病理过程,其活化已被证实见于动脉粥样硬化、肾纤维化、神经原性炎症、多种组织恶性肿瘤侵袭与转移等。已有资料表明,PAR2活化与呼吸系统多种疾病相关,在肺纤维化、肺癌、支气管哮喘等疾病的发生发展中均存在PAR2的显著活化。气道相关疾病研究结果显示PAR2激活后,可促进气道平滑肌及成纤维细胞增殖,炎症细胞大量浸润,上皮细胞化生及并呈现粘液高分泌状态,提示气道重塑、细胞特性改变,PAR2有可能作为调控细胞性状的关键开关分子。然而,广泛表达于肺组织内的PAR2是否可通过调节EMT过程、调控相关呼吸系统疾病进展,至今仍未见报道。此过程中,氧化应激作为调控EMT的重要信号,是否是PAR2影响细胞性状的关键通路以及存在哪些下游信号分子,迄今仍知之甚少。本文工作通过建立PAR2活化的原代细胞模型,首次发现PAR2活化可显著改变细胞特性、诱导气道上皮发生EMT,阐明了PAR2活化后可通过ROS/GRP78信号通路参与EMT调控的分子机制。研究结果不仅深化了对PAR2在呼吸系统中生理、病理功能的认识,并且揭示了PAR2可作为EMT、组织重塑病理过程的重要调控靶点,为疾病的临床治疗提供了新的思路。【目的】研究并阐明PAR2活化后对上皮细胞EMT过程的影响,探讨其触发EMT过程的具体分子机制。【方法】体外培养人原代支气管上皮细胞(human bronchial epithelial cells,HBEs),予以PAR2天然激动剂Tryptase及PAR2人工合成激动剂SLIGKV-NH2建立细胞PAR2活化模型。采用transwell、划痕实验测定细胞迁移能力,western blot法测定细胞上皮/间质特性分子E-cadherin、N-cadherin、α-平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)水平变化;采用免疫荧光法及流式细胞术检测胞内活性氧自由基(reactive oxygen species,ROS)含量,western blot法检测氧化/抗氧化酶系统——烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶-4(Nicotinamide adenine dinucleotide phosphate oxidase-4,NOX-4)及catalase水平,同时测定内质网应激蛋白葡萄糖调节蛋白78 kD(glucose-regulated protein 78 kD,GRP78)表达变化。【结果】随药物浓度增加,Tryptase及SLIGKV-NH2可浓度依赖性增强HBEs迁移能力(Tryptase≥100 pM,SLIGKV-NH2≥100μM),下调上皮细胞标志物E-cadherin表达,上调间质细胞标志物N-cadherin、α-SMA表达(P<0.05),细胞由上皮特性向间质特性转化;选择性PAR2抑制剂FSLLRY-NH2(FS)可取消上述Tryptase及SLIGKV-NH2的效应(P<0.05),提示EMT触发过程由PAR2特异性介导。激活细胞表面PAR2后,胞内ROS水平显著增高至对照组的135%,氧化酶NOX-4表达增加、抗氧化酶catalase表达降低,氧化/抗氧化失衡,该效应可选择性被PAR2抑制剂取消,提示氧化应激是PAR2活化后的重要胞内信号;给予ROS清除剂N-乙酰半胱氨酸(N-acetyl-cysteine,NAC),可完全取消PAR2活化后引起的上皮迁移能力增加、上皮/间质标志物变化,提示激活PAR2引起的EMT过程主要由氧化应激信号介导。PAR2活化后,胞内GRP78表达上调,PAR2抑制剂(P<0.05)及ROS清除剂(P<0.05)均可抑制该表达上调,提示GRP78可能是PAR2/ROS通路调节EMT过程的下游信号分子之一。【结论】选择性活化细胞表面PAR2可诱导HBEs发生EMT,其机制主要通过下游ROS/GRP78分子通路实现。本研究表明PAR2是组织重塑过程的重要调制者,揭示了新信号轴PAR2/ROS/GRP78可能作为调控上皮EMT过程的关键信号,丰富并拓展了呼吸系统疾病中对PAR2重要作用的新认识,为靶向重塑调控的呼吸系统疾病的临床治疗提供了新的靶标及理论依据。