背景和目的：血管平滑肌细胞(VSMC)从血管中膜向内膜下迁移，并在内膜聚集、增生，分泌大量的细胞外基质是所有损伤性血管疾病新生内膜形成共同的病理、生理性改变，由此引起的再狭窄(RS)，严重制约着这些疾病的疗效和预后。多种细胞因子和血管活性物质均参与了再狭窄的发生，其中血管紧张素II(Ang II)介导的生物学作用是其中重要的因素之一，其作用是通过VSMC细胞膜的AngII受体(ATR)介导完成的。现已阐明ATR有四种亚型，以AT1R和AT2R为主，存在于动物和人类的组织中。在成年心血管组织中，AngII所起的大多数作用是由AT1R介导的，而对AT2R则所知甚少，现有研究提示AT2R介导的许多生物学效应均与AT1R作用相拮抗，具有明显的负向影响作用。研究已证明AngII的促进新生内膜形成的作用主要是AT1R介导的，而对AT2R在其中所介导的作用则相对认识不足。本实验室研究结果也证实： AngII的促进VSMC迁移、增殖、肥大并抑制其凋亡，该作用主要是AT1R介导的；VSMC转染表达AT2R后， VSMC的迁移、增殖受到抑制、而凋亡增加。由于RS的发生除了与VSMC迁移、增殖能力改变密切相关外，VSMC细胞周期进展变化和细胞外基质大量堆积在再狭窄新生内膜形成过程中也起着同样重要的作用，不过，国内外相关的研究却很少。另一方面，由于AT1R在生长发育过程中始终保持较高水平的稳定表达，并且在血管损伤后表达进一步增加，而AT2R表达水平在出生后迅速降低，血管组织表达AT2R较少，或不表达。在这种情况下导入AT2R基因后，如果其表达处于无调控状态，将可能造成严重后果。基于这一认识，本研究拟构建可调控AT2R基因哺乳动物表达系统，利用该系统将AT2R基因导入VSMC使其在一定条件下进行可调控表达，在此基础上了解AT2R基因转染条件表达对体外培养VSMC细胞外基质的形成和VSMC细胞周期调控相关物质表达的影响，进一步探讨AT2R基因转染条件表达在再狭窄防治中的可行性及潜在意义。方法：(1)采用同源重组方法将AT2R目的基因片段克隆于含TetO重复序列的表达载体：pUHD10-3中，从而建立由调控质粒 pUHD 17-1hyg、哺乳动物表达质粒pUHD 10-3/AT2R、荧光报告质粒pUHC 13-3 以及提供新霉素筛选抗性的简单质粒 pSV2neo四种成分组成的受四环素类似物Doxycycline调控的哺乳动物表达系统(Dox-On系<WP=8>统)。(2)采用组织块贴壁法或胶原酶消化法原代培养大鼠主动脉VSMC。(3)采用常规分子生物学方法连续两个回合转染体外培养的VSMC, 并分别采用闪烁计数仪检测不同细胞克隆荧光素酶活性改变以及RT-PCR方法检测AT2R目的基因片段的mRNA表达情况，根据各个细胞克隆受Doxycycline调控表达的程度，选择高诱导表达AT2R目的基因但低背景的细胞系，作为双重稳定VSMC细胞系。(4)用不同浓度的Doxycycline、Ang II及AT1R、AT2R拮抗剂干预细胞，应用RT-PCR、流式细胞仪、蛋白免疫印迹及激光共聚焦显微镜检测该双重稳定VSMC细胞系 AT2R、AT1R的表达情况，了解在该双重稳定表达AT2R VSMC细胞系中，AT2R和AT1R的变化规律。(5)应用免疫细胞化学染色和RT-PCR技术观察该双重稳定表达AT2R VSMC细胞系中，VSMC表达p21、p53、细胞周期蛋白依赖性激酶2(CDK2)、增殖细胞核抗原(PCNA)、基质金属蛋白酶2(MMP2)、骨桥蛋白(OPN)、以及纤维粘连蛋白(FN)表达变化，运用Ang II及AT1R和AT2R拮抗剂干预细胞，了解AT2R表达对VSMC细胞外基质形成以及细胞周期调控的作用。结果：(1)采用DNA重组技术，成功构建携带大鼠AT2R目的基因片断的应答质粒载体pUHD10-3/AT2R，在此基础上组成Dox-on可调控哺乳动物AT2R目的基因表达系统。该系统由四个不同的质粒组成，它们分别是：调节质粒pUHD 17-1hyg、应答质粒pUHD 10-3/AT2R、荧光报告质粒pUHC13-3、筛选质粒pSV2neo。以上所有质粒经鉴定均与其背景资料相符合，可用于实现目的基因片断在靶细胞中可调控表达研究。(2)采用酶消化方法进行大鼠主动脉VSMC的原代细胞培养，所得细胞较纯，形态及生长状况较稳定，并经形态学及抗α-SM-actin免疫组化鉴定证实为VSMC。(3)经过两个回合的转染和严格筛选：第一回合转染将调节质粒pUHD 17-1hyg转染进入VSMC后利用潮霉素筛选、荧光素酶报告质粒进行瞬时转染表达分析，建立Dox-on VSMC细胞系；第二回合转染将应答质粒pUHD10-3/AT2R导入Dox-on VSMC细胞，利用G418筛选，并对目的基因AT2R的mRNA和蛋白表达进行检测，选择低背景表达高诱导表达的细胞系作为Dox诱导双重稳定表达AT2R基因VSMC细胞系。(4)Dox－on可调控哺乳动物表达系统可成功介导AT2R基因在原代培养大鼠主动脉VSMC的表达，该表达受到Dox给予/去除的紧密调控，且至少在12W内保持稳定且维持良好的Dox可诱导表达特性。(5)Dox干预可在48h内迅速诱导该VSMC细胞系表达AT2R，AT2R表达在Dox干预后72h进一步增强(P<0.01)；Dox在一定的浓度范围内(1×10－3～104 ng/ml)，呈剂量依赖性的增加该VSMC细胞系中AT2R mRNA和蛋白的诱导表达量(P<0.01)。AT2R mRNA和蛋白的诱导表达在Dox浓度在1×102～103ng/ml时达到峰值，更高浓度的Dox作用下，AT2R mRNA和蛋白表达量反而降低。(6)AngII干预该双重稳定表达VSMC后可以呈剂量依赖性上调AT2R的表达，AT1R拮抗