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目的研究Nrf2信号通路在PFOS诱导的神经元凋亡中的保护作用。方法1、(1)本研究采用24只SPF级6周成年SD大鼠为研究对象,随机分为3组,每组8只:对照组(PFOS:0 mg/kg),低剂量组(PFOS:1 mg/kg),高剂量组(PFOS:10 mg/kg),PFOS溶于0.5%Tween-20,采用灌胃方式,持续28天,每天定时称重,按大鼠体重变化调整灌胃剂量,建立PFOS染毒大鼠动物模型。(2)建模结束后,灌注并取材大鼠脑组织用于后续分析。(3)HE染色观察大鼠海马形态,免疫印迹分析bax和bcl-2的蛋白表达变化。(4)免疫印迹、免疫组化和免疫荧光的技术观察PFOS对大鼠脑组织中Nrf2信号通路相关蛋白表达以及定位的影响。2、(1)以SH-SY5Y人神经母细胞瘤细胞作为研究模型,通过不同剂量的PFOS(0、10、50、100和200μM)暴露48 h或200μM PFOS暴露不同时间(0、1、6、12、24和48 h)建立PFOS诱导的细胞凋亡模型。(2)免疫印迹检测Nrf2信号通路蛋白及凋亡相关蛋白的表达变化。(3)倒置显微镜拍摄SH-SY5Y细胞形态,CCK-8检测细胞活性,ROS试剂盒检测ROS产生。3、(1)使用ROS清除剂N-乙酰-L-半胱氨酸(N-acetyl-L-cysteine,NAC)对SH-SY5Y细胞进行预处理,随后暴露于200μM PFOS作用48 h。免疫印迹检测凋亡相关蛋白表达变化,免疫印迹和细胞荧光检测Nrf2信号通路的表达变化以及细胞定位情况。(2)使用Nrf2抑制剂brusatol对SH-SY5Y细胞进行预处理,随后暴露于200μM PFOS作用48 h,ROS试剂盒检测ROS水平变化。(3)两种抑制剂分别对细胞进行预处理,JC-1法和Mito Tracker?Red CMXRos荧光探针法检测线粒体膜电位及形态变化,免疫印迹检测SH-SY5Y细胞凋亡相关蛋白的表达变化,Cell Counting Kit-8(CCK-8)检测细胞活性变化。结果1、(1)HE染色发现PFOS引起海马神经元损伤,表现为胞体皱缩、排列紊乱和出现黑色细胞等。免疫印迹结果显示,PFOS处理后大鼠脑组织中bax蛋白表达呈现剂量依赖性上调而bcl-2蛋白表达呈现剂量依赖性降低(P<0.05)。(2)免疫印迹、免疫组化和免疫荧光检测发现PFOS引起大鼠脑组织中Nrf2信号通路的活化。2、(1)免疫印迹发现PFOS处理后的SH-SY5Y细胞中Nrf2通路活化,具有剂量依赖性和时间依赖性,凋亡相关蛋白呈现剂量依赖性增加(P<0.05)。(2)显微镜下观察到PFOS引起细胞形态皱缩和变圆,同时细胞活性降低,具有剂量依赖性(P<0.05)。(3)ROS试剂盒检测到PFOS引起细胞中ROS的产量增加(P<0.05)。3、(1)免疫印迹显示,NAC能够抑制PFOS诱导的凋亡相关蛋白的表达并缓解PFOS诱导的Nrf2信号通路的活化,细胞荧光显示是由于Nrf2入核受到了抑制(P<0.05)。(2)与PFOS单独暴露组相比,brusatol预处理后暴露于PFOS的细胞中ROS的表达进一步增加。(3)NAC预处理能够缓解PFOS引起的线粒体损伤、凋亡相关蛋白的活化和PFOS诱导的活性降低,而brusatol预处理则加重PFOS诱导的线粒体损伤、凋亡相关的蛋白活化和PFOS诱导的活性降低。结论1、PFOS暴露能够导致大鼠海马神经元以及SH-SY5Y细胞损伤,并激活Nrf2信号通路。2、PFOS引起的神经元细胞损伤与线粒体膜电位的改变以及线粒体形态的损伤密切相关。3、抑制Nrf2信号通路能够加重PFOS诱导的细胞损伤,提示Nrf2信号通路在PFOS诱导的神经毒性中具有保护作用。