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【研究背景和目的】原发性肝癌主要存在两种组织类型:肝细胞肝癌（Hepatocellular carcinoma,HCC）和肝内胆管细胞癌（intrahepatic cholangiocarcinoma,ICC）,其中肝细胞肝癌最常见,约占70%到85%[1]。肝炎病毒、酒精性肝病、黄曲霉毒素、吸烟、肥胖等被证明是肝癌发病的重要危险因素[2]。肝脏肿瘤的临床发生一般经历慢性肝炎,长期的慢性刺激或大范围急性病变发展成肝硬化,最终肝癌产生[1]。当前肝移植及手术切除等治疗方案均未明显改善患者预后,而且肝癌肝内和门脉转移对患者预后有重要影响[3]。肿瘤的发生发展是多种因素多阶段共同作用的结果[4],探索肝癌发生发展的机制,对于控制和治疗肝癌有十分重要的意义。PTEN（phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome 10）是第十号染色体缺失的磷酸酶与张力蛋白类似物。在一些高度恶性肿瘤中常有PTEN缺失,如Cowden综合征（Cowden’s syndrome）,又称多发性错构瘤综合征,它是PTEN胚系突变引起的常染色体遗传疾病[5]。PTEN具有蛋白磷酸酶和脂质磷酸酶活性,主要通过拮抗PI3K/AKT信号通路,调控多种生命过程[6],如细胞周期、细胞衰老、细胞黏附、极性、细胞骨架、染色体的完整性等[7]。同时也有大量文献报道PTEN在肿瘤恶性转化过程中起到了非常重要的作用[5]。上皮间质转化（epithelial-mesenchymal transition,EMT）是指由于各种因素的诱导,上皮细胞自身骨架结构改变,同时细胞间、细胞与基底膜间、细胞与细胞外基质之间联系也发生变化,获得间质细胞形态和特性的过程[8,9]。上皮间质转化在肿瘤恶性进展的过程中有十分重要的意义[10],有文献报道鼻咽癌细胞中,来源于EB病毒的miRNA EBV-miR-BART7-3p靶向抑癌基因PTEN,活化的PI3K/AKT/GSK-3β信号通路使核内Snail和β-catenin集聚促进EMT[11]。本课题组先前在探索PTEN肝癌中作用的过程中,发现肝癌中PTEN的表达并不因为其作为抑癌基因而减少,由此我们意图通过探讨PTEN在肝癌发生发展的过程中发挥作用的方式,以及其与EMT的关系,从而进一步为肝癌患者判断预后、评价转移风险及寻找肝癌治疗新靶点提供相关的实验和理论依据。【研究方法】1、通过蛋白免疫印迹法和实时定量PCR检测肝癌患者癌、癌旁、正常组织样品中PTEN的表达情况;并用免疫组织化学的方法,分析肝癌组织芯片中PTEN的表达。2、通过测序分析肝癌患者癌、正常组织以及肝癌细胞系中PTEN的突变情况;检索肿瘤基因组数据库（The Cancer Genome Atlas,TCGA）数据库信息,对PTEN在肝癌中的突变情况进行横向和纵向比较。3、通过蛋白免疫印迹法检测肝癌细胞系中pten的表达水平以及emt相关蛋白的表达水平;通过cck8增殖、迁移及侵袭实验比较不同亚群肝癌细胞的增殖、迁移、侵袭能力;在低糖培养基下,观察不同亚群细胞的耐受能力。4、建立干扰pten稳转细胞系,并用蛋白免疫印迹、rt-pcr检测干扰效果及其对于细胞emt状态的影响;评估细胞增殖、迁移、侵袭能力的变化。5、通过蛋白免疫印迹法观察肝癌细胞系中过表达pten后,细胞emt相关蛋白标志的变化;比较过表达pten对于细胞增殖、迁移、侵袭能力影响。6、使用tgf-β诱导肝癌细胞系发生emt,利用蛋白免疫印迹法及实时定量pcr观察诱导效果。7、使用tgf-β诱导干扰pten肝癌细胞系发生emt,利用蛋白免疫印迹法及实时定量pcr观察诱导效果。8、使用双荧光素酶报告基因系统,研究pten对于e-cadherin转录活性的影响。9、肝特异性敲除pten小鼠,使用den联合ccl4的方案进行诱癌,体内试验研究pten对于在肿瘤发生发展的作用。10、肝特异性敲除pten小鼠与k-ras激活突变小鼠杂交,观察小鼠生长。【研究结果】1、尽管pten作为抑癌基因,但是其在肝癌组织中的表达水平相较于癌旁和正常组织并不低。转录水平也证明癌中pten的表达要高于相应的癌旁和正常组织。组织芯片结果显示肝癌组织中pten表达并不低。2、27对临床肝癌组织样本以及肝癌细胞中未检测到pten的突变。检索tcga数据库,liverhepatocellularcarcinoma（amc,hepatology2014）和liverhepatocellularcarcinoma（tcga,provisional）中,pten突变分别为2%和7%。与其他种类的肿瘤纵向比较,突变水平很低。3、根据肝癌细胞系中emt相关标志蛋白的表达差异,分成以lo2、qsg-7701、smmc-7721、hcc-lm3、plc/ref/5、sk-hep-1为代表的m群,它们高表达vimentin;而e群细胞有hepg2、huh7、mhcc97h、mhcc97l、pvtt,它们高表达e-cadherin。m群细胞中pten的表达水平要明显高于e群细胞。m群的细胞增殖、迁移、侵袭能力总体上要比e群的细胞强,其生长更加依赖于葡萄糖。4、干扰pten,细胞内间质性相关指标如n-cadherin、vimentin在蛋白和rna水平均下调。同时,细胞的迁移和侵袭能力在干扰pten后要明显下降。5、上皮型huh7细胞随着pten腺病毒量的增加,转录因子snail的表达量升高,引起e-cadherin的下调,间质性标志vimentin表达上升。在间质型细胞smmc-7721,过表达PTEN,引起转录因子Snail上调的同时也促进了间质性指标N-cadherin、Vimentin的表达。而且这种作用随着PTEN过表达程度的增加,呈现出下降趋势,但仍维持在较高水平。SMMC-7721和Huh7细胞中过表达PTEN后:细胞的增殖能力呈现下降趋势;迁移能力在一定水平增加,超过一定程度出现减弱。6、TGFβ处理后,肝癌细胞PTEN的表达在蛋白水平上调。实时定量PCR也证明在转录水平,TGFβ的作用使细胞出现上皮间质转化,PTEN的表达上调。7、干扰PTEN背景下,TGFβ诱导细胞发生EMT的效应减弱。8、PTEN影响CDH1转录启动子区域转录活性;TGFβ促进PTEN启动子区转录活性。9、PTEN在肿瘤发生的早期具有抑癌作用。10、KPC小鼠自发生成胆管癌。【结论】在肝癌发生的早期,PTEN具有抑制肿瘤发生的作用。而在肝癌发生后,PTEN高表达促进上皮间质转化,低表达时肿瘤发生上皮间质转化能力相对降低。LSL-KrasG12D/+,PTENflox/flox,Alb-cre小鼠可以作为一种新型的胆管癌模型。