论文部分内容阅读
牙鲆(Paralichthys olivaceus),是我国最有经济价值的海水养殖种类之一。牙鲆病害问题日益突出,缺乏优良抗病品种,制约了产业的可持续发展。牙鲆免疫系统及病原防御机制研究缺乏,从转录组水平了解牙鲆免疫相关基因及信号通路,有助于深入了解鱼类的免疫系统和免疫防御机制。本研究进行了牙鲆脾脏转录组测序,发现了免疫相关基因及其信号通路,进一步研究了牙鲆热休克蛋白在温度刺激、病原感染和疫苗免疫下的表达,对深入理解鱼类的免疫系统和牙鲆的病害防治有很重要的意义。实验主要结果如下:1、研究了牙鲆感染鳗弧菌前后脾脏的转录组:取牙鲆感染鳗弧菌前后的脾脏制备文库,经Illumina Miseq测序后,共得到314,377个转录本。经Trinity拼接组装后得到96,627个非冗余Unigenes,在Nr数据库同源比对后得到21,392个Unigenes。注释后的Unigenes通过与GO、COG和KEGG数据库进行Blast X比对获得基因注释和功能分类信息,有12,503个Unigenes注释到GO的52个功能条目中;有19,547个预测蛋白注释到COG26个分子家族中,有10,649 unigene参与到KEGG六大类生化代谢途径中。对拼接后得到的96,627个Unigenes和斑马鱼的Unigenes以及牙鲆EST进行了同源性比较分析。有11,799的Unigenes和牙鲆EST序列有同源性,有4,442条Unigenes和斑马鱼的Unigenes同源。对注释后得到的21,392个unigenes进行了分类统计分析,有18,627个Unigenes来自鱼类,占整个注释Unigenes的87.1%;有778个来自其他脊椎动物(哺乳动物、鸟类、两栖类、爬行动物),占3.6%,有1.987个来自于植物和微生物,占9.3%。通过KEGG功能分类发现1,563个免疫相关基因序列,定位到15条免疫相关通路,首次发现TOLLIP、IRAK1/4、TRAF3/6、C2、C6、C8g、C5AR1等免疫基因在牙鲆的表达,为深入鱼类分子生物学和免疫防御机制研究奠定基础。从314,377个转录本中预测出47,362个SNP位点,其中转换位点为28,142,颠换位点有19,220个。在21,392个Unigenes中发现了40,928个SSR位点;在1.563个免疫通路相关基因中发现有1,579个SNP位点,分布在339个Unigenes上。比较感染鳗弧菌和未感染鳗弧菌的转录组,发现有189个差异表达显著的unigene,其中上调表达的38个,下调表达的151个。2、牙鲆热休克蛋白基因的转录表达通过荧光定量PCR技术检测了温度刺激、鳗弧菌感染、疫苗免疫后牙鲆热休克蛋白基因Hsp10、Hsp40A4、Hsp60、Hsp70和Hsp110的表达。比较了热休克蛋白家族基因在健康牙鲆脾脏中的表达变化。Hsp90β的表达量最高,其次是Hsp90α和Hsp70,而Hsp10和Hsp110的表达量最低。热休克蛋白基因在牙鲆的肝、脾、头肾、后肾,心脏,腮,脑、胃、中肠、血、腹肌,背鳍、背皮12个组织中都有不同程度的表达,不同的热休克蛋白基因在不同组织间表达的差异较大。以中肠、肝脏和腹肌等组织中的表达量最高。牙鲆在5℃、10℃、16℃、22℃、28℃和32℃不同温度处理1h后,不同的热休克蛋白基因间的表达差异较大。Hsp40和Hsp70对冷胁迫不敏感,对热激敏感,在28℃和32℃热激时,大量表达;Hsp10在冷胁迫和32℃热激时表达下调,28℃热激时表达量增加;Hsp60对低温和高温都不敏感;Hsp110对低温敏感,在28℃热激时表达量显著增加。热休克蛋白基因在冷胁迫(10℃)和热激(28℃)1h、3h、5h、8h后,表达量发生不同程度的变化。Hsp10和Hsp70在冷胁迫后表达量下调;Hsp40、Hsp60和Hsp110表达类似,表达量上调,在5h时表达量最高。热休克蛋白基因对热激敏感,除了Hsp60表达量没有显著变化,其余热休克蛋白基因表达量显著增加,3h达到峰值,特别是Hsp70和Hsp40在28℃热激后,表达量迅速增加。研究了热休克蛋白基因在鳗弧菌M3感染和灭活鳗弧菌免疫的牙鲆脾脏中的转录表达。鳗弧菌感染后,不同的热休克蛋白基因在6h、12h、24h和72h表达变化不同。大部分热休克蛋白基因在细菌侵染后,表达是下调的,而Hsp60表达上调。灭活鳗弧菌免疫1d、3d、7d、14d后,热休克蛋白基因在免疫初期1d时,表达都是上调的,3d时除了Hsp60表达上调外,其余都是表达下调,7d和14d时大多回到正常水平,和对照组没有显著差异。