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到目前为止,所有与修饰后细蛋白结合的蛋白鉴定仅限于生物化学方法,而在基因组范围内的筛选工作还很少,有报道在细胞内表达异源性的蛋白激酶,用双杂合试验进行翻译后修饰特异性结合蛋白的筛选.如:在酵母中表达酪氨酸激酶或在大肠杆菌中表达哺乳动物丝氨酸/苏氨酸激酶,以使底物磷酸化后再用双杂合试验来进行筛选.由于磷酸化过程依赖于传统的酶-底物反应(反式作用),如果外源性的酶难以从宿主细胞中众多的蛋白中识别特异蛋白底物则接下来的筛选可能失败.因此,为提高底物磷酸化的效率,增加"诱饵"蛋白的特异性就必须过量表达激酶,而这样可使宿主细胞中蛋白被不当修饰导致细胞生长停滞.为使细胞内酵母双杂合试验"诱饵"蛋白能特异地、持续修饰,我们将Gcn5 HAT结构域和组蛋白H3尾相连,这样酶与底物的物理性连接可能使"自体催化"现象发生在一个蛋白分子内而产生高效率的乙酰化修饰.我们将组蛋白H3尾(1-59位氨基酸)与Gcn5(18-252位氨基酸)野生型相连,再连接Ga14DNA结合结构域和HA;用无HAT活性的Gcn5变异体作为对照.将含有上述融合蛋白ORF的质粒和载体对照分别转入酵母细胞中(PJ69-4 α),用抗HA和抗组蛋白H3K9/K14乙酰化抗体检测酵母全细胞提取液中人工融合蛋白的工作情况.我们还构建了GAL4DBD-H4-Gcn5 wt-HA和GAL4DBD-H4-Gcn5 F221A-HA重组体,试验表明:GAL4DBD-H4-Gcn5 wt-HA融合蛋白有自体乙酰化现象(H4K8)而GAL4DBD-H4-Gc n5F221 A-HA则无.为检测融合蛋白能否用于酵母双杂合筛选试验,我们与华盛顿大学的Stanley Fields博士合作进行高通量酵母双杂合筛选试验.为探索Rmtl在体外甲基化活性与组蛋白乙酰化的关系,我们提出了以下假设:Rmt1甲基化那些已预先乙酰化的H4或H3(位置尚待确定)之精氨酸,而那些乙酰化位置可以结合Rmt1.但因为Rmt1的靶组蛋白可能占有很少的百分比,或仅仅在特殊情况下才存在(即在某些基因开放时),因此RMT1缺陷不会造成H4甲基化明显减少.为检验上述假设,我们进行了体外甲基化试验.综上所述,我们成功地构建了酵母自体乙酰化双杂合筛选系统.用这一系统,我们筛选出了Rmt1、Yap6和Rpm2三个候选蛋白,Rmt1与乙酰化H3和H4反应,而Rpm2和Yap6则与乙酰化H3反应.我们已知上述蛋白的生物学功能,因此,它们与乙酰化组蛋白的关联应该与染色体功能有关.