异基因造血干细胞移植（allo-HSCT）是目前多种恶性和非恶性血液系统疾病的唯一根治手段。基于抗胸腺细胞球蛋白（ATG）和粒细胞集落刺激因子（G-CSF）为基础的非体外去T细胞单倍型移植（北京方案）模式和国外单倍型移植后环磷酰胺后置（PTCY）模式的建立和完善,allo-HSCT彻底告别供者来源缺乏的时代,在全球范围内得到广泛应用。尽管单倍型造血干细胞移植的疗效不断改善,移植物抗宿主病（GVHD）仍然是主要的合并症。尤其是发生在移植后100内的急性移植物抗宿主病（aGVHD）,发生率约为35-64%,Ⅱ级以上aGVHD死亡率高达50%,是接受造血干细胞移植患者非复发性死亡（NRM）的主要原因。目前GVHD主要采用免疫抑制剂（糖皮质激素、钙调蛋白酶抑制剂、CD25单抗）以及JAK2抑制剂、CD20单抗等。这些药物在缓解排异症状和降低死亡率的同时削弱了移植物抗白血病效应（GVL）,增加了感染风险。30%-50%的患者会发生激素难治性/耐药性aGVHD（SR-GVHD）,更强的免疫抑制治疗与感染和恶性肿瘤复发的发生率增加有关。因此,目前aGVHD临床患者亟待安全有效、成本效益上更优,技术要求较低的新的预防和治疗策略。aGVHD是异基因造血干细胞移植后患者体内重建的供者来源的免疫细胞攻击受者脏器组织导致的临床综合征,主要累及皮肤、肝脏、消化道等。尽管目前aGVHD发生的确切机制尚不完全清楚,但研究认为,aGVHD发生过程涉及多种免疫细胞和非免疫细胞,如Th1,Th2,Th17等细胞均起到促进aGVHD发生发展的重要作用。此外,患者造血干细胞移植前接受的放化疗预处理方案会导致患者体内产生大量的活性氧（ROS）,ROS进一步触发炎症反应从而导致组织损伤,加重aGVHD,在aGVHD的发病机制中发挥关键作用。因此,合理控制氧化应激,尤其是ROS的产生对于有效管理aGVHD至关重要。核因子红系衍生的2相关因子2（NFE2L2,或Nrf2）是细胞对抗氧化损伤和外源性刺激的主要调节因子。Nrf2属于亮氨酸拉链蛋白,通常情况下与胞浆伴侣蛋白Keap 1相合,处于相对抑制状态,稳定存在于细胞质中。当受到ROS等氧化应激条件刺激后,Nrf2与Keap1解偶联并转位到细胞核。Nrf2在细胞核内与下游抗氧化反应原件结合,激活一系列解毒酶和抗氧化应激基因的表达,如血红素加氧酶1（HO-1）、超氧化物歧化酶（SOD）等。Nrf2-HO1信号通路及其下游基因已经被证实在多种细胞、组织和器官的氧化应激中发挥重要作用。因此,我们认为Nrf2/HO1信号通路可以通过减低ROS水平从而抑制aGVHD的发生发展。高压氧治疗（HBOT）是一种临床中常用的治疗方法,已经广泛应用于一氧化碳中毒、减压病、缺血性脑和脊髓损伤等缺血缺氧性疾病的治疗。临床研究表明,HBOT可以显著改善继发于aGVHD的非愈合性口腔溃疡和allo-HSCT后GVHD或感染导致的出血性膀胱炎。此外,HBOT已被证实可减少一系列的促炎性细胞因子释放,削弱炎症反应的发生。以往的研究也记载了脑外伤和糖尿病足溃疡患者接受HBOT过程中Nrf2起到关键调节作用。本研究通过观察HBOT在临床患者的实际应用和实验室小鼠模型中的治疗效果和临床意义,探索HBOT对aGVHD的治疗有效性。进一步验证Nrf2基因的表达在HBOT治疗aGVHD中的生物学作用及机制,为aGVHD的预防、治疗及新型靶向治疗提供理论依据和实验室基础。第一部分:小鼠异基因造血干细胞移植后急性移植物抗宿主病模型的建立目的:本部分研究旨在建立稳定可靠的小鼠异基因造血干细胞移植后的急性移植物抗宿主病模型,为后续探究高压氧疗法（HBOT）对急性移植物抗宿主病的治疗有效性及相关发生机制提供可靠的临床前模型。材料与方法:1.实验动物以5-6周龄,体重18-20g的雄性C57/BL（H-2Kb）小鼠作为供鼠,7-8周龄,体重20-22g的雌性BALB/C（H-2Kd）小鼠为受鼠。无菌环境中提取供鼠脾脏单个核细胞和胫腓骨骨髓腔中的骨髓单个核细胞,利用PBS制备骨髓及脾脏单个核细胞悬液。受鼠在异基因造血干细胞移植术前接受全身照射（TBI）,接受照射后在6小时内通过尾静脉将骨髓单个核细胞和/或脾脏单个核细胞悬液回输至受鼠体内。2.TBI剂量的探索受鼠随机分为4组,分别接受6.5Gy,7Gy,7.5Gy,8Gy四种不同TBI剂量照射,观察照射后小鼠状态及生存时间,确定最低致死照射剂量。3.骨髓及脾脏单个核细胞回输数量的确定受鼠在最低致死照射剂量预处理后,随机分为四组,将骨髓细胞悬液浓度与以往文献一致,调整为1×107个/200 ul,脾脏单个核细胞浓度分为四个梯度,分别为 5×106个/200 ul、1×107个/200 ul、2×107个/200 ul、3×107个/200 ul。观察每组受鼠的体重变化、活动状态及出现aGVHD的时间及生存时间,确定最佳的脾脏单个核细胞悬液浓度。4.小鼠急性移植物抗宿主病模型建立的确定一周后处死部分小鼠,提取胫腓骨骨髓细胞,处理后采用流式细胞术检测移植后各组小鼠的嵌合状态及植入情况,确定供鼠骨髓细胞是否成功植入。通过每天记录小鼠体重变化、活动度改变、生存时间长短及aGVHD的典型表现（耸毛、大面积脱毛、皮肤皱褶、弓背、腹泻、肛门肿胀等）确定小鼠是否进入aGVHD状态。采用aGVHD临床评分,每隔7天对小鼠aGVHD发生的严重程度及进展进行记录。采用伊红—苏木精（HE）对小鼠皮肤、肝脏、肠道、脾脏和肺等靶器官组织进行病理染色组织检查,观察小鼠是否发生aGVHD病理学改变,确定小鼠aGVHD模型的成功建立。结果:1.TBI剂量四组小鼠分别接受6.5Gy,7Gy,7.5Gy,8Gy四种不同TBI剂量照射后,前两组小鼠长期存活,说明该剂量为非致死剂量;8Gy组小鼠于7天内全部死亡,7.5Gy组小鼠于9-14天内出现陆续死亡,表明7.5Gy为最低致死剂量。2.骨髓及脾细胞数小鼠于异基因造血干细胞移植术前接受总剂量为7.5Gy,剂量率83cGy全身照射,在全身照射后的4-6小时内通过尾静脉将骨髓单个核细胞和脾单个核细胞回输至受鼠体内。骨髓细胞数按照以往文献确定为1×107个,脾细胞数分为四个梯度,分别为 5×106个/200 ul、1×107个/200 ul、2×107个/200 ul、3×107个/200 ul。TBI组小鼠仅接受TBI全身照射,未回输供鼠骨髓及脾单个核细胞,全部小鼠于9-12天内死亡。BMT组小鼠接受TBI照射后仅回输骨髓细胞1×107个,全部小鼠开始出现体重降低,但是在7天后逐渐恢复至正常体重,状态良好且长期存活（>35天）。aGVHD组小鼠回输骨髓细胞1×107及4个梯度的脾脏细胞后,5×106个/200 ul组小鼠未诱导出aGVHD典型表现,且全部长期存活。2>×107个/200 ul及3× 107个/200 ul两组小鼠均出现典型的aGVHD表现,但后者组小鼠在20天内全部死亡。仅2×107个脾细胞组小鼠出现典型的aGVHD,且在35天内全部死亡,说明小鼠清髓后回输1×107个骨髓细胞和2×107个脾细胞能够成功建立aGVHD小鼠模型。3.小鼠急性移植物抗宿主病模型成功构建小鼠接受剂量为7.5Gy的TBI全身照射,并在照射后4-6小时内通过尾静脉回输骨髓单个核细胞1×107和2×107个脾单个核细胞,移植术后小鼠体重逐渐下降,活动度明显降低。移植后第7天提取小鼠骨髓细胞进行流式细胞术嵌合度检测,显示供鼠组织相容性抗原H-2Kb 阳性细胞嵌合率均在95%以上,表明供鼠骨髓单个核细胞植入成功。小鼠于14天左右开始出现耸毛、弓背、腹部及背部大片脱毛、腹泻及肛门肿胀等典型aGVHD临床症状,并于35天内全部死亡。HE染色可见小鼠靶器官组织镜下出现aGVHD发生时的炎性细胞浸润,局部有明显的炎症反应。结论:本部分研究通过分梯度预实验成功地确定构建aGVHD小鼠模型所需的TBI剂量及骨髓细胞和脾细胞回输数量,并通过观察小鼠形态、体重、生存期,检测嵌合度、小鼠靶器官病理改变和aGVHD评分等确定小鼠发生aGVHD的程度及进展,成功地构建了稳定的小鼠aGVHD模型,为后续进一步观察HBOT在小鼠中对异基因造血干细胞移植后aGVHD中的治疗效果。第二部分:高压氧疗法通过Nrf2/HO-1信号通路对小鼠急性移植物抗宿主病治疗的作用及机制研究目的:本研究旨在探究高压氧疗法（HBOT）对异基因造血干细胞移植（allo-HSCT）后小鼠急性移植物抗宿主病（aGVHD）的治疗效果;阐明Nrf2/HO-1信号通路在HBOT防治aGVHD中的作用及其机制,探究aGVHD预防及治疗的潜在新靶点,为提高异基因造血干细胞移植患者后aGVHD患者治疗效果的有效途径提供实验室理论依据。材料与方法:1.aGVHD小鼠模型的建立;2.流式细胞术检测小鼠骨髓嵌合;3.H&E染色;4.组织免疫荧光;5.Luminex检测外周血多因子表达水平;6.免疫组织化学染色（Immunohistochemistry,IHC）;7.蛋白提取及免疫印迹分析（Western Blotting）;8.统计学分析。结果:1.采用流式细胞不检测异基因造血干细胞移植后受鼠骨髓嵌合度显示供鼠的H-2Kb阳性细胞嵌合率均在95%以上。2.通过成功建立小鼠异基因aGVHD模型并应用HBOT后结果显示,小鼠生存期显著延长且临床表现明显改善,aGVHD严重程度评分显著降低。HBOT可显著降低aGVHD发生率且明显减轻小鼠aGVHD。3.采用HE染色技术检测受鼠靶器官组织病理改变,结果显示aGVHD小鼠在HBOT后靶器官病理损害显著减轻。4.组织免疫荧光染色结果显示,aGVHD小鼠在接受HBOT后靶器官内ROS含量较对照组显著下降。5.采用Luminex技术检测小鼠治疗前后外周血中多种炎性细胞因子变化显示,HBOT治疗后HGF水平显著升高,IL-6和TNF-α水平显著降低,IL-2、IL17、IL4、IL10和IFN-γ等没有显著性改变。6.免疫组织化学染色和Western Blotting结果显示,以单纯骨髓移植组小鼠为对照组,aGVHD组小鼠治疗后靶器官中Nrf2和HO1蛋白水平表达量升高。7.免疫组织化学染色和Western Blotting结果显示,以未使用HBOT组小鼠为对照组,aGVHD-HBOT组小鼠治疗后Nrf2和HO1蛋白水平表达量明显升高。8.aGVHD-HBOT组部分小鼠接受Nrf2抑制剂ML385干预后结果显示,小鼠生存期明显缩短,且临床表现及评分显著升高。结论:通过本课题的研究证实HBOT可以显著改善异基因造血干细胞移植aGVHD小鼠的临床表现及严重程度。本研究通过成功地建立aGVHD小鼠模型,进一步证实HBOT可以显著延长小鼠的生存期和改善小鼠aGVHD临床表现。小鼠肝中Nrf2及HO-1蛋白在HBOT治疗aGVHD后的表达水平增高,或许能够为aGVHD患者开辟新的防治途径。本研究证实Nrf2基因的表达降低能够显著促进小鼠aGVHD的发生发展和严重程度。HBOT能过够通过激活Nrf2-HO1信号通路,减少多种炎性细胞因子和ROS的释放,从而减轻对aGVHD靶器官的损害,减轻aGVHD的发生发展。通过本课题的研究,我们首次明确了 Nrf2-HO1信号通路在HBOT改善aGVHD发生发展中的中重要作用,为临床治疗提供新靶点。第三部分:高压氧疗法对急性移植物抗宿主病治疗有效性的临床验证目的:本部分研究旨在探究HBOT在临床实际应用时对于异基因造血干细胞移植后aGVHD患者的治疗效果,为临床aGVHD患者的治疗提供新的思路与手段。材料与方法:本研究对2012年06月至2020年11月于山东大学附属省立医院血液内科住院接受异基因造血干细胞移植（allo-HSCT）治疗后发生急性移植物抗宿主病的83例患者进行临床资料分析,同时收集患者外周血样本进行研究。83例患者中,发生aGVHD后仅接受类固醇激素治疗的患者53例,接受激素合并HBOT患者30例。男性52例,女性31例,年龄8-65岁,中位年龄27岁。ALL22例,AML 4例,SAA 6例,MDS 4例,淋巴瘤5例,其他5例。患者采用白消安（busulfan,BU）/环磷酰胺（cyclophosphamide,CY）或全身照射（total body irradiation,TBI）/CY,改良BU/CY,BU/氟达拉滨（fludarabine,FLU）预处理方案;两组患者均采用甲氨喋呤（methotrexate,MTX）+环孢素 A（cyclosporine,CSA）+吗替麦考酚酯（mycophenolate mofetil,MMF）方案预防 aGVHD。aGVHD 的诊断和治疗参照美国国立卫生研究院（NIH）共识标准。采用RT-PCR检测83例患者外周血单个核细胞中Nrf2和HO-1基因表达水平。回顾性观察并评估这些患者接受HBOT治疗后aGVHD的控制情况和分级变化、外周血中CD3+CD4+T细胞、CD3+CD8+T细胞、NKT细胞、白细胞介素6（IL-6）和CD4/CD8比值变化。本研究符合医学伦理学要求,已通过山东大学附属省立医院医学伦理委员会的审核批准,根据赫尔辛基宣言所有患者及健康志愿者在采集标本前均已签署知情同意书。结果:1.在83例接受异基因造血干细胞移植后发生急性移植物抗宿主病患者仅接受常规激素治疗1-2mg/kg/d的患者53例,合并HBO治疗的患者为30例。两组患者aGVHD Ⅰ-Ⅱ级发生率分别为67.9%vs.86.7%,aGVHD Ⅲ级发生率分别为32.1%vs.13.3%,HBOT治疗组发生aGVHD的严重程度显著低于未使用HBOT组,结果有显著性差异（P=0.001）。此外,30例患者使用HBOT前后aGVHD分级显著降低,其中30%患者aGVHD症状完全消失。2.HBOT治疗后,CD3+CD4+T细胞显著下降,CD3+CD8+T细胞和NKT细胞数量增加,白细胞介素6（IL-6）和CD4/CD8比值较治疗前下降,差异有显著性差异。3.Real-time PCR结果表明临床患者使用HBOT后外周血中Nrf2及HO-1基因表达没有显著性改变。结论:通过本课题的研究证实HBOT在aGVHD的实际临床应用中可以显著改善异基因造血干细胞移植aGVHD患者的临床表现及降低aGVHD分级,对于临床中常用的aGVHD相关临床指标有显著的改善作用,为临床中异基因造血干细胞移植后的aGVHD病人提供新的治疗手段。