文昌鱼被认为是现存与脊椎动物最接近的原索动物,代表着从无脊椎动物到脊椎动物进化过程中的一个重要的过渡阶段,是研究脊椎动物起源与进化的经典实验模型。它的基因序列和表达模式被广泛的应用于比较基因组学研究以及发育同源性分析。nif源于nitrogen fixation,指固氮基因簇,包括nifU、nifH、nifD、nifK和nifV等基因,它们编码的一系列产物参与固氮反应各个环节。其中,nifU可以分为三个区域:N-末端区域,C-末端区域和一个中心区域。只具有N-末端区域的基因通常称为nifU-like基因。本文从青岛文昌鱼的肠cDNA文库中(本实验室保存)得到一个cDNA克隆L052(Genbank accession number: AY279520),它全长630bp,含有一个495bp的开放阅读框(ORF),编码一个164氨基酸残基组成的多肽,推导的分子量为17.51kDa。该cDNA还包含有一个55bp的5’非编码区(UTR),其中包含一个终止密码子TGA;一个30bp的3’非编码区和一个多聚腺苷酸尾巴(polyA)。其编码的蛋白在5’末端有一起始密码子ATG,在3’末端有一终止密码子TAA。所以,L052 cDNA克隆具有完整的编码区。序列比对显示,L052编码的蛋白与来自于不同物种的NifU-like蛋白具有很高的同源性,高达66-86%;而且它具有高度保守的U-type基序(motif) (C-X26-C-X43-C),这个基序是NifU-like蛋白的典型特征。因此我们初步认为L052 cDNA克隆编码NifU-like蛋白。然而,本实验室的cDNA文库是以文昌鱼肠RNA为基础构建而成,肠道内残留食物有很多是菌类。为了证明L052 cDNA克隆不是来自于污染微生物,而是来自于文昌鱼本身,我们设计了以下实验。首先,以文昌鱼精巢和卵巢RNA为模板,根据L052 cDNA序列设计引物,