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猪流行性腹泻(Porcine epidemic diarrhea,PED)是由猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)引发的一种以呕吐、腹泻和脱水为特征的高度接触性肠道传染病,各年龄猪群均易感,尤其对哺乳仔猪的危害最大,死亡率高达90%,对全球的养猪业造成巨大的经济损失。研究发现,变异的PEDV毒株无法使现有的疫苗进行有效的免疫,因此,从遗传学角度提高仔猪对流行性腹泻的抵抗力,分离和筛选抵御PEDV的抗性功能基因及其有效分子标记,培育出可高效抵御该疾病的新品种是防控PED最有效的方法。已有研究表明,细胞表面受体猪氨肽酶N(Aminopeptidase N,APN)是否为PEDV感染宿主细胞的功能性受体还存在争议,但其表达水平确实与PEDV的感染能力密切相关,然而具体的分子调控机制仍不明确。因此,本研究以猪小肠上皮细胞系(Porcine intestinal epithelial cell line,IPEC-J2)为研究对象,首先检测APN基因在PEDV侵染不同时间点的表达规律,然后构建APN基因敲除细胞系,探讨APN基因对IPEC-J2细胞基本功能的影响,进一步分析APN基因功能及敲除后对PEDV侵染能力的影响。其次,分离和鉴定APN基因启动子区SNPs,检测甲基化程度对其基因表达水平的影响,揭示APN基因表达调控的分子机理。最后,利用RNA-seq技术分析PEDV侵染12 h后APN基因敲除前后的基因表达变化,筛选APN靶向的关键基因,其结果如下:1.利用qRT-PCR分析APN基因在PEDV侵染IPEC-J2细胞不同时间点(0、2、4、6、12、24h)的表达差异;PEDV侵染4h时,其表达量极显著上调(P<0.01),且持续到12 h时达到最高,侵染24 h时表达量极显著下调(P<0.01)。同时,成功构建APN基因敲除的IPEC-J2细胞系,比较该基因敲除前后不同培养时间点(24、48、72 h)对IPEC-J2细胞的活性和周期的影响,同时分析了参与调控细胞周期重要基因的表达水平差异。结果表明,APN基因敲除后,IPEC-J2细胞在不同培养时间点的活性均呈现极显著的下调(P<0.01),处于G1时期的IPEC-J2细胞比例显著增加(P<0.05),S时期细胞比例极显著减少(P<0.01),调控G1时期的重要调控因子Cyclin D1、Cyclin E1、CDK4、CDK2、p21基因的表达水平极显著上调(P<0.01)。此外,借助qRT-PCR技术开展PEDV不同侵染时间点(4、12、24 h),PEDV拷贝数在PEDV侵染APN敲除和野生型细胞不同时间点的差异分析。结果发现,APN基因敲除后,PEDV拷贝数在不同侵染时间点均极显著下调(P<0.01);与此同时,利用间接免疫荧光技术检测PEDV侵染12 h后,APN基因敲除前后IPEC-J2对PEDV易感性的影响,结果表明,APN基因敲除后,IPEC-J2细胞中存在的PEDV颗粒明显减少,其对PEDV的易感性降低。2.运用生物信息学软件预测猪APN基因的核心启动子区,分析筛选位于该区域的SNPs位点,利用双荧光素酶报告基因检测试剂盒鉴定SNPs对启动子活性影响,结果发现该基因存在3个可能的核心启动子区域,且位于rs322147864(G/A)和rs326030589(G/A)的突变极显著增加了APN基因启动子的活性(P<0.01)。此外,采用BSP测序法检测PEDV侵染前后IPEC-J2细胞中APN基因启动子区甲基化水平,并分析部分位点甲基化水平与APN基因表达水平的相关性。结果发现,APN基因启动子区上游2.5kb内存在2个CpG岛,结合软件生成的甲基化引物,最终锁定350 bp的CpG岛,共包含18个CpG位点。BSP测序表明,感染组APN基因启动子甲基化水平与对照组并无显著差异,与mRNA表达水平的相关性分析显示,CpG1位点的甲基化水平与其表达水平呈极显著正相关(P<0.01)。3.将PEDV侵染APN基因敲除细胞系和野生型细胞系作为处理组和对照组,进行转录组分析,共筛选到3943个差异表达基因,包括3121个上调表达基因以及822个下调表达基因。这些差异基因主要富集到刺激反应、信号转导、生物质量调节、多细胞生物过程、受体活性、分子转导活性信号受体等GO terms中;主要参与环磷酸、蛋白消化和吸收、金黄色葡萄球菌感染、细胞因子受体相互作用、炎症介质对TRP通道的调节、钙离子、细胞黏附分子、白细胞跨内皮迁移等信号通路中。结合生物学功能,从差异表达基因中选择10个基因:CLDN8、DPPA2、FBP1、GTSF1、LAMA1、RGN、CD177、KRT4、LRRC7、MUC13,借助qRT-PCR检测发现,其表达趋势与转录组测序结果一致。本研究进一步分析了 APN基因表达水平与PEDV的抗性关系及其调控机制,APN基因的高表达可能有利于提高IPEC-J2细胞对PEDV的易感性,且该基因启动子区的SNPs对其表达水平存在重要的调控作用,可能与PEDV的抗性密切相关。此外,转录组分析初步揭示了 APN可能参与PEDV抗性过程中的相关通路和下游调控基因。这些研究结果为深入研究APN基因抗性作用机制及其在猪流行性腹泻抗病育种中的应用奠定基础。