研究背景:膀胱癌（Bladder Cancer,BC）是一种异质性恶性肿瘤。在全球范围内每年大约有40万例新发病例,对全球人类生命健康造成严重威胁。膀胱癌发病率具有三大特点:1.与年龄密切相关,随着人类年龄的增长,膀胱癌发病率逐渐升高;2.地域差异性,在不同地理区域之间,膀胱癌发病率存在巨大差异,发达国家的膀胱癌年龄标准化发病率（Age-standardized rate,ASR）明显高于发展中国家;3.性别差异性,男性膀胱癌发病率明显高于女性,男女比例为9.0:3.2。但有趣的是,如果按临床分期统计,女性膀胱癌复发率明显高于男性,提示我们膀胱癌的发生发展机制有待于进一步探讨。目前为止,手术切除、化学疗法、放射疗法与免疫治疗等多种治疗方法均被广泛用于膀胱癌治疗。但是,上述治疗方法总体疗效依旧欠佳,无法达到根治效果。因此,发掘并明确调控膀胱癌发生发展的关键调节因子及其具体分子机制,对于膀胱癌治疗具有重要的临床意义,这也是近年来膀胱肿瘤研究领域的重点、热点和难点。Rho相关蛋白激酶1（Rho-associated protein kinase 1,ROCK1）作为 ROCK 家族的成员之一,主要是通过调控下游蛋白的磷酸化过程,参与肌动蛋白骨架的组织和动态调控等正常生理过程。除此之外,ROCK1已被证实在肝细胞癌、黑色素瘤、前列腺癌、肺癌、乳腺癌、骨肉瘤及胶质细胞瘤在内等多种类型肿瘤中表达水平升高,参与肿瘤细胞新血管生成、迁移、侵袭和转移等过程,并在这些过程中发挥重要调节作用。但是,有关ROCK1在膀胱癌细胞中发挥作用的具体分子作用机制以及与患者预后和存活率的相关性目前尚未完全明了,有待于进一步发掘与研究。研究目的:明确ROCK1在膀胱癌组织样本与不同膀胱癌细胞系中表达水平,探讨膀胱癌样本组织中ROCK1的表达水平与膀胱癌各项临床指标之间的相关性,明确ROCK1在膀胱癌中发挥的细胞生物学作用以及在膀胱癌发生发展中所扮演的角色。探讨ROCK1是否可以成为膀胱癌诊断的预测标志物,或者为膀胱癌靶向治疗的临床研究提供新的提示与线索。研究方法:为了明确ROCK1在膀胱癌中表达水平以及膀胱癌患者临床表现与预后的关系,本研究首先系统性回顾分析了 64例膀胱癌患者临床资料与随访结果;随后,通过 qPCR、Western blot 和免疫组织化学（Immunohistochemistry,IHC）等方法测定膀胱癌患者的肿瘤样本组织及其相应对照组中ROCK1的mRNA与蛋白表达水平。探讨ROCK1表达水平与膀胱癌TNM分期之间的相关性,并通过Kaplan-Meier生存曲线进一步分析组织样本中ROCK1表达水平与膀胱癌患者总体生存率之间的关系。随后,通过qPCR和Western blot等方法测定SW780、T24、TCCSUP、UMUC-3和5637膀胱癌细胞系中ROCK1的mRNA与蛋白表达水平,从中筛选出高表达ROCK1的膀胱癌细胞系。然后,以高表达ROCK1的膀胱癌细胞系为载体,使用RNA干扰技术敲低细胞中ROCK1的表达水平,建立稳定敲除ROCK1的膀胱癌细胞系,进而通过CCK-8和集落形成实验验证敲低ROCK1蛋白表达水平对膀胱癌细胞增殖能力的影响。最后通过膜联蛋白V-FITC/PI染色及流式细胞仪分析检测不同ROCK1表达水平的膀胱癌细胞凋亡水平,并通过蛋白质印迹实验进一步验证ROCK1表达变化对膀胱癌细胞抗凋亡能力的影响。研究结果:通过对符合入组条件的64例患者进行系统性回顾分析和患者随访,并同时检测ROCK1在肿瘤样本组织中的表达水平,我们发现在临床膀胱癌组织样本中ROCK1的mRNA、蛋白的表达水平均显著高于周围正常膀胱组织。不仅如此,ROCK1表达水平的升高与淋巴结转移发生率,尤其是盆腔转移率密切相关;除此之外,与早期阶段（Ta-T1）和较小体积（≤3cm）膀胱肿瘤相比,在晚期（T2-T4）和大体积（>3cm）膀胱肿瘤组织样本中ROCK1的表达水平明显升高。随后,以ROCK1的表达水平为标准,当癌组织mRNA表达量高于癌旁组织时定义为高表达,当癌组织mRNA表达量低于癌旁组织时定义为低表达,将病人分为高表达组（n=37）和低表达组（n=27）。在60个月的随访中,与ROCK1低表达组（n=27）相比,ROCK1高表达组（n=37）生存时间明显缩短,并且ROCK1高表达的患者有更多的淋巴结转移,且转移多发生在盆腔。进一步的IHC结果证实,相对于癌旁组织,ROCK1蛋白在肿瘤组织中的表达明显升高。而在SW780、T24、TCCSUP、UMUC-3和5637五种膀胱癌细胞系中,ROCK1的mRNA和蛋白水平均显著增加,尤其是UMUC-3和T24细胞系。在此基础上,我们以UMUC-3和T24细胞为载体,利用RNA干扰技术敲低UMUC-3和T24细胞中ROCK1的表达并建立稳定细胞系。随后,我们通过CCK-8和集落形成实验,分别进一步检测降低膀胱癌细胞中ROCK1的表达水平对膀胱癌细胞系细胞增殖能力和集落形成能力的影响。结果显示,与Scramble组相比,降低UMUC-3和T24细胞中ROCK1的表达水平不仅能够明显抑制UMUC-3和T24细胞的细胞增殖能力,还能够显著抑制UMUC-3和T24细胞的集落形成能力。综上所述,ROCK1参与了膀胱癌细胞的细胞增殖能力和集落形成能力的调控,并且发挥重要的调节作用。进一步的流式细胞分析结果显示,敲低细胞中ROCK1可以显著诱导UMUC-3和T24细胞的凋亡,通过Western Blot实验进一步证明,敲低膀胱癌细胞UMUC-3和T24的ROCK1表达能够增加膀胱癌细胞UMUC-3和T24中促凋亡蛋白Bax和Cleaved-Caspase 3的表达同时降低抗凋亡蛋白Bcl-xl的表达。所有这些结果表明,敲低ROCK1可能促进膀胱癌的细胞凋亡,而ROCK1在膀胱癌增殖的侵袭过程中发挥着重要作用。研究结论:在膀胱癌中,在肿瘤体积较大的膀胱癌组织中ROCK1的表达水平显著高于肿瘤体积较小的膀胱癌组织,并且,ROCK1高表达的膀胱癌患者的生存期显著短于ROCK1低表达患者,当膀胱癌细胞中存在高水平的ROCK1表达,预示着患者发生转移、死亡等不良预后,提示ROCK1的表达水平与膀胱癌的发生和发展明确相关。降低膀胱癌细胞UMUC-3和T24中ROCK1的表达可以抑制膀胱癌的细胞增殖与细胞集落形成,并通过调节膀胱癌细胞UMUC-3和T24中促凋亡蛋白Bax、c-Caspase 3与抗凋亡蛋白Bcl-x1表达水平促进细胞凋亡,初步证明ROCK1在人类膀胱癌的进展过程中发挥着重要作用,可以成为膀胱癌诊断的预测标志物,并为膀胱癌靶向治疗临床研究提供新的提示与线索,有望用于弥补临床上现有检测与治疗手段的不足。