论文部分内容阅读
背景和目的:卵巢癌是妇科最常见的恶性肿瘤之一,因生长迅速,早期即可在腹腔内扩散,故五年生存率较低,死亡率居妇科恶性肿瘤首位。肿瘤的发生发展是多因素、多步骤、多阶段和多基因参与并发生改变的过程.目前普遍认为,肿瘤的发生机制与肿瘤细胞的失控性增殖有关,近年来,细胞增殖在肿瘤中的研究已经成为热点。AnnexinⅡ蛋白是钙离子介导的磷脂结合蛋白,其编码基因定位在染色体15q21-q22。研究发现,AnnexinⅡ蛋白在DNA合成及细胞增殖等方面起重要作用,而且胞外的AnnexinⅡ蛋白还作为受体,参与纤溶、细胞之间粘附、配体介导的信号转导等。近来,有研究报道在乳腺癌、肺癌、原发性肾癌中都观察到AnnexinⅡ表达增高的现象。但又有研究显示:AnnexinⅡ蛋白在前列腺癌组织中的表达降低。因此,AnnexinⅡ蛋白表达与肿瘤的关系需要进一步研究。c-myc是一种比较保守的转录调节因子,参与调控细胞的增殖、分化、以及细胞的恶性转化。研究发现AnnexinⅡ能与c-myc癌基因的mRNA结合从而延长其半衰期,使c-myc蛋白的表达上调。核转录因子-κB(nuclear transcription factor-κB,NF-κB),是一类重要的核转录因子,主要形式为p50和p65组成的异源二聚体,p65参与基因转录起始的调控,并能促进p50与DNA结合,p50是与DNA结合的部位。它可调控多种基因的表达,与肿瘤的发生、浸润及转移均有密切的关系。最近研究发现AnnexinⅡ蛋白可作为受体与胃泌素结合,然后通过激活MAPK/ERK的信号转导途径激活NF-κB,从而介导胃泌素对AR42J胰腺癌细胞系的增殖和抗凋亡作用。近年来,AnnexinⅡ蛋白在食管癌、胃癌、乳腺癌的表达及其意义的研究国内外都有报道。但AnnexinⅡ蛋白在卵巢癌组织中的表达以及与c-myc、NF-κB表达相关性的研究,至今为止,还未发现相关的文献报道。己酮可可碱(pentoxifylline,PTX),为磷酸二酯酶抑制剂,PTX在肿瘤治疗中的作用已引起人们的关注,PTX对体外培养卵巢癌细胞的直接作用和对AnnexinⅡ的表达影响,国内外尚未见报道。为探讨AnnexinⅡ、NF-κBp65、c-myc在卵巢癌的表达情况和临床意义以及它们间的相互关系,AnnexinⅡ基因在PTX干扰下的表达情况。本研究采用免疫组织化学方法对AnnexinⅡ、NF-κBp65、c-myc蛋白在卵巢良性肿瘤和卵巢癌组织中的表达情况进行检测。采用细胞免疫化学检测了PTX作用人卵巢癌细胞株H0-8910PM前后AnnexinⅡ蛋白的表达变化,采用细胞原位杂交和RT-PCR技术检测了PTX作用前后AnnexinⅡmRNA的表达变化。从基因、蛋白、细胞定位等多个方面深入探讨AnnexinⅡ在卵巢癌发生发展中的作用。为进一步探讨卵巢癌发生、浸润、转移机制及寻找抑制卵巢癌发生、发展的途径提供理论基础。材料与方法:1.采用免疫组织化学方法研究AnnexinⅡ、NF-κB p65、c-myc蛋白在92例卵巢癌组织和26例卵巢良性肿瘤中的表达情况,并进行形态学观察。2.以不同浓度PTX作用人卵巢癌细胞株H0-8910PM用MTT法检测不同浓度PTX对人卵巢癌细胞株H0-8910PM的增殖抑制率。3.采用免疫细胞化学检测PTX作用前、后AnnexinⅡ在人卵巢癌细胞株H0-8910PM中蛋白的表达情况。4.采用细胞原位杂交方法检测PTX作用前、后AnnexinⅡ在人卵巢癌细胞株H0-8910PM中mRNA的表达情况。5.采用RT-PCR方法检测PTX作用前、后AnnexinⅡ在人卵巢癌细胞株H0-8910PM中mRNA的表达情况。6.统计学处理:应用SPSS11.0软件处理,采用χ~2检验、t检验和方差分析。检验水准α=0.05。结果:1.AnnexinⅡ蛋白阳性表达主要位于卵巢癌细胞膜,AnnexinⅡ蛋白在26例卵巢良性肿瘤中和92例卵巢癌中的阳性表达率分别为46.15%(12/26)和78.26%(72/92),两组间比较差异有统计学意义(P＜0.05)。在浆液性卵巢癌组织中的阳性表达率为77.78%(56/72),粘液性卵巢癌组织的表达率为80.0%(16/20),两组间阳性表达率进行比较无显著差异性(P＞0.05)。AnnexinⅡ蛋白的阳性率与卵巢癌的病理分级无关(P＞0.05),(G1级、G2级、G3级卵巢癌组织中分别为75.0%,79.41%,78.95%)。在FIGO分期Ⅰ期和Ⅱ期的卵巢癌中的表达阳性率为52.94%(18/34),Ⅲ期和Ⅳ期为93.10%(54/58),两组间阳性表达率比较有显著性差异(P＜0.05)。不伴有淋巴转移组为60.0%(24/40),伴有淋巴转移组为92.31%(48/52),两组间阳性表达率比较有显著性差异(P＜0.05)。2.NF-κBp65蛋白表达于肿瘤细胞的胞浆内,NF-κBp65蛋白在26例卵巢良性肿瘤中和92例卵巢癌中的阳性表达率分别为23.08%(6/26)和67.39%(62/92),两组间比较差异有统计学意义(P＜0.05)。在浆液性卵巢癌组织中的阳性表达率为66.67%(48/72),粘液性卵巢癌组织的表达率为70.0%(14/20),两组间阳性表达率进行比较无显著差异性(P＞0.05)。NF-κBp65蛋白的阳性率与卵巢癌的病理分级显著相关(P＜0.05),(G1级、G2级、G3级卵巢癌组织中分别为30.0%,76.47%,78.95%)。在FIGO分期Ⅰ期和Ⅱ期的表达阳性率为38.24%(13/34),Ⅲ期和Ⅳ期为84.48%(49/58),两组间比较差异有统计学意义(P＜0.05)。不伴有淋巴转移组为52.50%(21/40),伴有淋巴转移组为78.85%(41/52),两组间阳性表达率比较有显著性差异(P＜0.05)。3.c-myc蛋白表达于肿瘤细胞的胞核内,c-myc蛋白在26例卵巢良性肿瘤中和92例卵巢癌中的阳性表达率分别为38.46%(10/26)和82.61%(76/92),两组间比较差异有统计学意义(P＜0.05)。在浆液性卵巢癌组织中的阳性表达率为83.33%(60/72),粘液性卵巢癌组织的表达率为80.096(16/20),两组间阳性表达率进行比较无显著差异性(P＞0.05)。c-myc蛋白的阳性率与卵巢癌的病理分级显著相关(P＜0.05),(G1级、G2级、G3级卵巢癌组织中分别为40.0%,88.24%,100.0%)。在FIGO分期Ⅰ期和Ⅱ期的卵巢癌中的表达阳性率为64.71%(22/34),Ⅲ期和Ⅳ期为93.10%(54/58),两组间比较差异有统计学意义(P＜0.05)。不伴有淋巴转移组为65.0%(26/40),伴有淋巴转移组为96.15%(50/52),两组间阳性表达率比较有显著性差异(P＜0.05)。4.AnnexinⅡ蛋白与NF-κB p65、c-myc蛋白的表达均呈正相关性(P＜0.05)。5.PTX作用后细胞生长曲线显示:各PTX处理组H0-8910PM的增殖受到一定程度抑制。各PTX处理组H0-8910PM细胞数量仍是随时间延长逐渐增多,但与对照组相比,细胞数量明显减少,并随剂量的增加和时间的延长其抑制作用越来越明显。6.MTT法测量PTX作用于H0-8910PM细胞的抑制率显示:不同浓度的PTX(0.25mg/ml -2.0 mg/ml)作用于H0-8910PM 12h、24h、48h、72h,各组抑制率均数的比较有统计学意义(P＜0.05)。其中PTX 0.25mg/ml组与对照组比较,48h后差异具有显著性(P＜0.05);PTX 0.5、1.0、1.5、2.0mg/ml组在各时间点与对照组比较,其差异均具有显著性(P＜0.05)。7.AnnexinⅡ蛋白在人卵巢癌细胞株H0-8910PM中高表达:以0.5mg/ml、1.0mg/ml、1.5mg/ml、2.0 mg/ml 4种不同浓度PTX作用人卵巢癌细胞系H0-8910PM 24h、48h、72h后,AnnexinⅡ蛋白较空白对照组有所降低;同一时间段内随着浓度增加,AnnexinⅡ蛋白表达降低,且呈浓度依赖性,4个剂量组与空白组相比,差异有统计学意义(P＜0.05)。同一时间段内4个剂量组两两相比,差异有统计学意义(P＜0.05);同一剂量组随着时间延长AnnexinⅡ蛋白表达逐渐降低,各时间段两两相比,差异有统计学意义(P＜0.05)。8.AnnexinⅡ的mRNA在人卵巢癌细胞株H0-8910PM中高表达。以0.5mg/ml、1.0mg/ml、1.5mg/ml、2.0 mg/ml 4种不同浓度PTX作用人卵巢癌细胞系H-8910PM24h、48h、72h后,AnnexinⅡmRNA较空白对照组有所降低;同一时间段内随着浓度增加,AnnexinⅡmRNA表达降低,且呈浓度依赖性,4个剂量组与空白组相比,差异有统计学意义(P＜0.05)。同一时间段内4个剂量组两两相比,差异有统计学意义(P＜0.05);同一剂量组随着时间延长AnnexinⅡ蛋白表达逐渐降低,各时间段两两相比,差异有统计学意义(P＜0.05)。9.细胞未经干扰前可见AnnexinⅡ阳性表达条带,以0.5mg/ml、1.0mg/ml、1.5mg/ml、2.0 mg/ml 4种不同浓度PTX作用人卵巢癌细胞系H0-8910PM48h后,AnnexinⅡ阳性条带的亮度逐渐减弱,以2.0 mg/mlPTX作用48h后AnnexinⅡ条带的亮度最弱,各实验组与空白组相比,差异均有统计学意义(P＜0.05)。各剂量组间两两比较,差异具有统计学意义(P＜0.05)。结论:1.AnnexinⅡ蛋白在卵巢癌组织中的表达显著高于卵巢良性上皮性肿瘤,提示其表达可能与卵巢癌的发生有关。AnnexinⅡ蛋白的表达与卵巢癌的临床分期和淋巴结转移显著相关,提示其表达可能对卵巢癌的发展和转移有促进作用。2.NF-κB p65、c-myc蛋白的表达与卵巢癌的病理分级、临床分期和淋巴结转移有显著相关,提示NF-κB p65、c-myc蛋白的过表达参与了卵巢癌的发生、发展和浸润转移。3.AnnexinⅡ蛋白的表达与NF-κB p65、c-myc蛋白的表达均呈正相关。提示AnnexinⅡ蛋白的表达可能通过调节NF-κB p65、c-myc蛋白的表达,从而促进了卵巢癌的发生、发展和浸润转移。4.PTX对H0-8910PM卵巢癌细胞的增殖有明显的抑制作用,PTX可能通过抑制AnnexinⅡ基因的表达,抑制肿瘤细胞的增殖。