1前言目前白内障患者导致的眼盲占全世界眼盲患者的50%,现在公认眼内晶状体受到氧化应激的损伤是白内障的主要原因。上皮细胞是氧化应激的主要目标。研究表明,过氧化氢诱导的氧化应激能够刺激人晶状体上皮(HLE)细胞凋亡,还有研究显示除了先天性白内障以外,其他各种类型的白内障发生的细胞学基础都被认为是和细胞凋亡有关。因此通过研究人HLE细胞凋亡的机制可能会为白内障防治提供更多理论依据。2目的研究在氧化应激诱导的HLE细胞的凋亡中Eaf2基因所起的作用和相关分子机制,并进一步探讨Eaf2基因如何通过抑制caspase-3活性、激活Wnt信号通路保护HLE细胞抑制过氧化氢导致的凋亡。3方法3.1细胞培养:在含20%FBS的MEM培养基中培养HLE-B3细胞。培养条件:5%CO2、饱和湿度、37℃。3.2过氧化氢诱导HLE-B3细胞凋亡:将HLE-B3细胞用50μM过氧化氢别处理 4h、8h和 12h。3.3载体构建和细胞转染:构建Eaf2的过表达,Eaf2基因的CDS全长被克隆并连接到pcDNA3.0载体;用Wnt3a干扰载体(Wnt3ashRNA)敲低Wnt3a,Wnt3ashRNA购自SantaCruz生物,同时匹配其NC,shCon(干扰载体空载)。确认Eaf2过表达的细胞,同时转染shWnt3a/shCon。3.4检测分析细胞凋亡:将过氧化氢处理HLEC-B3细胞后,用流式仪检测细胞,计算凋亡率。3.5 RNA提取和RT-PCR分析:采用TRIZOL法从细胞中提取总RNA,将RNA逆转成cDNA,用2-(?)Ct计算方法来比较各组间β-catenin,caspase 3,Eaf2,and Wnt3a mRNA的表达水平。3.6 免疫印迹分析:采用 western blot 检测 β-catenin,caspase 3,Eaf2,and Wnt3a 的蛋白水平。3.7免疫细胞化学:免疫荧光检测Eaf2和Wnt3a在细胞中的定位情况。4结果4.1.构建H202诱导的HLE细胞凋亡的模型。分别用50μM H2O2处理HLE细胞4、8、12小时后,凋亡细胞的比率均显著高于对照组(无H2O2处理组),并且凋亡率增加具有时间依赖性。RT-PCR和westemBlot结果均显示当细胞暴露于H2O2后,HLE-B3细胞中caspase 3mRNA和蛋白水平均明显上调,并且具有时间依赖性;Eaf2mRNA和蛋白水平显著下调,并且具有时间依赖性。4.2 Eaf2过表达抑制H2O2诱导的HLE细胞凋亡。Eaf2高水平过表达下,凋亡细胞的比例显著降低(p<0.001),同时LDH释放量显著降低(p<0.05)。RT-PCR和western blot分析显示Eaf2过表达的细胞中,凋亡相关蛋白caspase 3、Bax的mRNA和蛋白水平显著下调;Bcl-2的mRNA和蛋白达水平显著上调,说明Eaf2基因通过调节凋亡相关蛋白的表达而抑制过氧化氢诱导晶状体上皮细胞的凋亡。Eaf2过表达的细胞中Wnt3a和Wnt通路的关键蛋白β-catenin的mRNA和蛋白达水平均显著上调;Wnt通路中的抑制剂GSK3β蛋白水平明显下调,其磷酸化物p-GSK3β蛋白水平明显上调,提示Eaf2 and Wnt3a信号通路有密切的关系。免疫荧光也显示Eaf2过表达细胞中Eaf2和Wnt3a明显上调。4.3 Eaf2通过调控Wnt3a抑制HLE细胞中H202诱导的凋亡转染shWnt3a质粒干扰Wnt3a表达后,即使在Eaf2过表达情况下,HLE-B3细胞凋亡总比率仍显著增加,同时使已经被压抑的LDH释放量增加。RT-PCR和western blot显示Wnt3a敲低后caspase 3、Bax的mRNA和蛋白水平明显上调;Bcl-2的mRNA和蛋白水平明显下调,β-catenin、p-GSK3β的蛋白水平明显下调;GSK3β蛋白水平明显上调。说明Wnt3a被敲低后会影响到Eaf2对于HLE细胞的保护作用,Eaf2是通过调控Wnt3a抑制HLE细胞中H202诱导的凋亡。5.结论5.1 H2O2可以诱导晶状体上皮细胞发生凋亡。5.2在晶状体上皮细胞中可有效地转染Eaf20E质粒及shWnt3a质粒。5.3 Eaf2蛋白对过氧化氢诱导的晶状体上皮细胞的凋亡具有抑制作用。5.4第一次证明Eaf2基因转录产物可以保护HLE细胞免受暴露于过氧化氢导致的氧化应激损害。5.5 Eaf2通过调节凋亡相关蛋白(caspase 3、Bax、Bcl-2)的表达保护HLE细胞,抑制过氧化氢诱导的凋亡。6、Eaf2通过对Wnt3a信号通路的作用抑制过氧化氢导致的氧化应激损害。