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目的:本研究旨在探究羟基磷灰石(hydroxyapatite,HA)对脂肪间充质干细胞(adipose derived stem cell,ADSCs)成骨分化的影响,并利用HA和ADSCs来促进C57BL/6小鼠的骨损伤后修复。方法:(1)体外分离野生型C57BL/6小鼠原代ADSCs,通过传代培养(Subculture)的方式扩增和纯化分离的原代ADSCs;通过流式细胞检测技术鉴定分离的ADSCs;将第二代的ADSCs消化后,按照1×10~4个细胞/孔接种至96孔细胞培养板中。(2)将HA加入接种ADSCs的96孔细胞培养板中,CCK-8检测不同浓度的HA(0μg/mL、50μg/mL、100μg/mL、200μg/mL、500μg/mL、1,000μg/mL、5,000μg/mL)吸光度(Absorbance)值,分析HA对ADSCs生长的影响。(3)利用HA诱导ADSCs成骨分化,并利用碱性磷酸酶(Alkaline Phosphatase,ALP)试剂盒检测ADSCs的分化程度;使用RNA提取试剂盒提取各组细胞中的RNA,RT-PCR检测成骨相关基因(BGLAP、ALP、OPN、COL1A1、Runx2)以及成脂相关基因(FABP4、LPL、CEBPα、PPARγ)的表达量,评估HA诱导成骨效果。(4)使用野生型C57BL/6小鼠建立股骨骨折模型,将实验动物分为假手术组、对照组(生理盐水组)、ADSCs组、HA和ADSCs混合组四组,除假手术组外分别向骨折部位注入20μL的生理盐水、RFP-ADSCs悬液、HA和RFP-ADSCs混合液。15天后,取出股骨进行相关的组织病理分析与检测。结果:(1)成功建立了C57BL/6小鼠ADSCs的原代培养体系,通过传代培养大量扩增ADSCs,利用流式细胞检测技术,检测ADSCs的表面标记(CD45、CD44、CD29、Sca1),成功鉴定出ADSCs。(2)将不同量的HA加入到贴壁生长的ADSCs中,经过24h的培养,,使用酶标仪测量各组的吸光度值。在应用200μg/mL的HA时,ADSCs存活率最高,因而,我们在后续实验中选用200μg/mL的HA诱导ADSCs成骨分化。(3)经过15天HA诱导后,显微镜下观察发现部分ADSCs发生了形态变化,ALP染色阳性,HA为40μg/mL时,染色效果最好。诱导15天后,提取ADSCs的总RNA,逆转录为cDNA进行定量PCR检测,与未经HA诱导的ADSCs相比,诱导组的ADSCs成骨相关基因的表达水平发生了不同程度的升高,差异具有统计学意义(P<0.05),而成脂相关基因的表达量低,没有统计学意义(P>0.05)。(4)取出经15天治疗后的骨折模型小鼠的股骨,发现四组间小鼠股骨的长度发生了变化,骨折前测量的小鼠股骨长度均在1.2cm(±0.1cm),治疗后对各组小鼠股骨取平均值,假手术组长度最长,约1.81cm(±0.1cm),对照组最短,约1.41cm(±0.1cm),ADSCs治疗组为1.49cm(±0.1cm),HA和ADSCs混合治疗组1.69cm(±0.1cm)。经过HE和Masson胶原染色,HA和ADSCs混合治疗组的骨痂愈合程度较高,胶原的分泌量较多,ADSCs治疗组的骨折愈合程度低于HA和ADSCs混合治疗组,但治疗效果仍优于对照组。结论:本实验建立了完善且成熟的原代ADSCs分离培养体系,通过体外实验发现合适浓度的HA能够诱导ADSCs向成骨细胞方向分化。HA和ADSCs混合组对股骨骨折模型的治疗效果优于单纯的ADSCs治疗组,可以促进小鼠股骨骨折后的修复治疗与损伤愈合,并有望应用到其它骨缺损相关疾病的治疗中。