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枯草芽孢杆菌因具有较清晰的遗传背景和良好的胞外分泌性,并且其胞外分泌物无致病性,使其成为生物技术领域基础研究和工业应用研究中使用较多的重要菌种。枯草芽孢杆菌模式菌株168(Bacillus subtilis subsp.subtilis str.168)不仅能分泌木聚糖水解酶(Endo-1,4-β-xylanase A,Xyn A)和(Glucurono xylanase C,Xyn C),还能分泌阿拉伯呋喃糖水解酶(Arabinoxylan arabinofuranohydrolase,Axh43)。本文研究了枯草芽孢杆菌168分泌的水解酶Xyn A和Xyn C单独作用及协同作用下在枫香树甲基葡萄糖醛酸木聚糖(Methylglucuronoxylans,Me GXn)中的酶解作用;枯草芽孢杆菌衍生菌株(Bacillus subtilis MR42,MR44,MR45)在Me GXn中的生长情况及酶解产物,筛选出适合生产酸性木寡糖的菌株;Axh43在结构更为复杂的甜高粱秆阿拉伯糖甲基葡萄糖醛酸木聚糖(Methylglucuronoarabinoxylans,Me GAXn)中的酶解作用;筛选出的适合生产酸性木寡糖菌株在Me GAXn中的酶解产物结构。主要研究结果如下:1.重组表达的枯草芽孢杆菌168分泌的Xyn A和Xyn C在Me GXn中的酶解作用通过对重组表达的枯草芽孢杆菌168分泌的水解酶Xyn A和Xyn C单独作用及协同作用下在枫香树木聚糖(Me GXn)中的酶解作用的研究,结果表明:Xyn A和Xyn C由于自身酶解特性不一,对底物的结合特异性也有一定的差异,因此作用于Me GXn时可产生出不同长度的酸性木寡糖。借助薄层色谱法(TLC)、基质辅助激光解析电离飞行时间质谱法(MALDI-TOF-MS)与核磁共振氢谱法(1H NMR)对酶解得到的产物进行鉴定,结果表明Xyn A对底物的特异选择性较低,酶解出来的产物结构呈多样化,分别为中性木寡糖主要为木二糖(X2)和木三糖(X3)以及酸性木寡糖主要为甲基葡萄糖醛酸木四糖(Me GX4),并且甲基葡萄糖醛酸(Me G)侧链只连接在非还原端次位木糖上,证实Xyn A可以直接将木聚糖水解成短链的木二糖和木三糖,而当有Me G侧链出现的情况下,只能酶解特定的位点。Xyn C为具有高度特异性的酶,能识别Me G侧链,并只作用于连接着该基团木糖的靠近还原端的邻位木糖上,主要酶解产物为Me GX7,Me G侧链只连接在还原端次位木糖上,且不产生中性木寡糖,这也印证了其对底物的高度结合特异性,因此木聚糖水解酶Xyn C的酶解产物可控性较Xyn A的酶解产物可控性高。当Xyn A与Xyn C共同作用时,由Xyn A水解得到的Me GX4被Xyn C进一步水解而得到最终的酶解产物Me GX3,其中Me G侧链连接在中间的木糖上。2.生产酸性木寡糖菌株的筛选通过绘制枯草芽孢杆菌衍生菌株在Me GXn中的生长曲线并测定最终的总糖含量,借助TLC法、MALDI-TOF-MS法和1H NMR法对酶解产物进行鉴定,结果表明:枯草芽孢杆菌衍生菌株MR42和MR44在生长25 h后,菌液中总糖含量和主要产物有差异。菌株MR42(只分泌木聚糖水解酶Xyn A,xyn C基因受到干扰)在生长25 h后菌液中总糖含量为43%,其主要产物为Me GX4,Me G侧链连接在非还原端次位木糖上,与Xyn A酶解反应中的酶解产物一致;菌株MR44(只分泌木聚糖水解酶Xyn C,xyn A基因受到干扰)在生长25 h后总糖含量为75%,其主要产物为Me GX7,Me G侧链只连接在还原端次位木糖上,与Xyn C酶解反应中的酶解产物一致。对两个菌株总糖含量和产物结构的综合分析,筛选出菌株MR44用于酸性木寡糖的生产。3.重组表达的Xyn A,Xyn C和Axh43在Me GAXn中的酶解作用通过对重组表达的枯草芽孢杆菌168分泌的水解酶Xyn A,Xyn C和Axh43单独作用及协同作用下在甜高粱秆木聚糖(Methylglucuronoarabinoxylans,Me GAXn)中的酶解作用研究,利用TLC法和1H NMR法对酶解产物进行结构鉴定,结果表明:Axh43能直接释放出连接在木糖主链上的阿拉伯呋喃糖基团而不水解木糖主链,证实了其只具有水解阿拉伯呋喃糖侧链的酶解活性。而Xyn A与Axh43共同作用时,Axh43仍能释放阿拉伯呋喃糖,且Xyn A的水解产物则与以枫香树木聚糖为底物时的水解产物相似,主要为Me GX4,Me G侧链的连接位置在非还原端次位木糖。Xyn C与Axh43的共同水解产物则为分子量较大的酸性木寡糖,平均聚合度为12。4.枯草芽孢杆菌168衍生菌株MR44在Me GAXn中的酶解产物通过绘制MR44菌株在Me GAXn底物中的生长曲线并对最终产物进行总糖含量测定和结构鉴定,结果表明:在酶解反应48 h后,产物中总糖含量为70%,释放出的阿拉伯糖被细菌本身代谢。利用阴离子交换色谱柱(QAE Sephadex Q25)对菌液进行纯化得到酸性木寡糖,借助TLC法和1H NMR法对产物进行鉴定,发现产物的平均木糖单元长度约为12,平均每12个木糖单元只连接着一个Me G侧链,且Me G侧链只连接在还原端次位木糖上。本试验分析的木聚糖酶Xyn A和Xyn C以及阿拉伯呋喃糖水解酶Axh43的酶解作用及产物,有助于人们有针对性的应用它们对农林生物质进行降解而获得目的产物;筛选出的能生产特定长度的酸性木寡糖的枯草芽孢杆菌衍生菌株,为农林生物质的高值化利用提供了思路。