研究背景肝细胞性肝癌(以下简称肝癌)对于放化疗均不敏感,手术切除后复发率高,常导致肝癌治疗的失败。肿瘤干细胞是肿瘤中一小群具有自我更新、无限增殖、多向分化及转移迁徙特性的细胞,被认为是肿瘤复发、转移及放化疗耐受的主要原因之一。针对肿瘤干细胞的靶向疗法为肝癌治疗提供了崭新思路。目前有多个分子作为表面标志物用于分离肝癌中的肿瘤干细胞,包括CD90,Ep CAM,CD133,CD24、OV-6和CD44,但不清楚哪个标志物更具有普遍性,更适合于临床应用。microRNA(miRNA)是一类非编码的小RNA,数量众多,长度通常在17-27个碱基之间。miRNA主要通过与信使RNA(m RNA)的3’-端非翻译区(3’-UTR)发生碱基互补配对,使得靶m RNA降解或蛋白质翻译受到抑制,由此实现在转录后水平对基因表达的负向调控。在人类肿瘤中发现一系列的miRNA参与了肿瘤干细胞群体的维持及干细胞特性的调控,如增殖、迁移、侵袭及放化疗耐受。但是调控CD90阳性肝癌干细胞的miRNA目前还不清楚。丝裂原活化蛋白3激酶8(MAP3K8)是丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶家族的一个成员,与多种人类肿瘤的形成和进展密切相关。MAP3K8在肿瘤中的作用有着两面性,在大多数肿瘤,例如乳腺癌、结肠癌、肾癌、子宫内膜癌、胃癌、鼻咽癌、胸腺瘤和淋巴瘤中,MAP3K8都发挥着促进肿瘤的作用。MAP3K8与NF-κB信号通路有着错综复杂的相互调节的关系,而NF-κB在很多肿瘤中都被激活,并参与了肿瘤干细胞的维持、扩增及存活,这些现象提示MAP3K8可能参与了肿瘤干细胞的调节。但是在肝癌中,尤其是在肝癌干细胞中,MAP3K8是否发挥作用以及发挥何种作用并不清楚。研究方法1通过流式细胞技术检测各肝癌干细胞表面标志物在肝癌细胞株中的表达,通过细胞成球实验研究干细胞培养环境对于CD90表达的影响。通过q RT-PCR、细胞成球、平板克隆形成、Transwell侵袭小室及裸鼠成瘤验证CD90阳性肝癌细胞的干细胞特性。2通过miRNA微阵列芯片探索与CD90阳性肝癌干细胞相关的miRNA,并用q RT-PCR验证芯片结果。其中我们选择了mi R-589-5p作为研究对象,转染mi R-589-5p mimics使其过表达,并探索mi R-589-5p对CD90阳性肝癌干细胞特性的影响。3通过计算机预测mi R-589-5p下游靶蛋白,利用荧光素酶报告实验、q RT-PCR及Western blot验证mi R-589-5p对靶蛋白MAP3K8的直接调控作用。4利用si RNA干扰MAP3K8的表达,研究MAP3K8对CD90阳性肝癌干细胞特性的影响。5通过免疫组织化学和q RT-PCR分别检测CD90和mi R-589-5p在原发性肝癌中的表达,并统计分析CD90和mi R-589-5p的表达对于肝癌患者预后的影响。研究结果1在被检测的肝癌干细胞表面标志物中,只有CD90在各个肝癌细胞株中均有阳性表达,且稳定在一个比例较低的水平,即使在细胞成球后仍是如此。CD90阳性肝癌细胞具有肝癌干细胞特性,比如表达干细胞相关基因,具有更强的自我更新、迁移、侵袭及成瘤能力。2 miRNA微阵列芯片发现,与CD90阴性细胞相比,CD90阳性肝癌细胞中有3个上调的miRNA以及6个下调的miRNA。q RT-PCR证实mi R-589-5p和mi R-33b-5p在CD90阳性肝癌细胞中下调。转染mi R-589-5p mimics可以使mi R-589-5p过表达,并抑制CD90阳性肝癌干细胞特性,包括干细胞相关基因的表达、自我更新、迁移、侵袭及成瘤能力。3荧光素酶报告基因显示mi R-589-5p可以与MAP3K8 m RNA的3’-UTR直接结合。在CD90阳性肝癌干细胞中过表达mi R-589-5p将降低MAP3K8的m RNA和蛋白水平。4转染MAP3K8 si RNA能抑制MAP3K8的表达,并抑制CD90阳性肝癌干细胞特性,包括干细胞相关基因的表达、自我更新、迁移及侵袭能力。5 CD90在原发性肝癌组织中均有表达,且表达于一小群肝癌细胞中。mi R-589-5p和CD90的表达量在肝癌组织中呈负相关。CD90高表达和mi R-589-5p低表达的肝癌患者更容易发生血管侵犯及术后复发,且无瘤生存率及总生存率较低,预后不良。结论1.CD90是理想的肝癌干细胞标志物,CD90阳性肝癌细胞表达干细胞相关基因、具有自我更新、迁移、侵袭及体内成瘤等肝癌干细胞特性。2.mi R-589-5p可抑制CD90阳性肝癌细胞的肿瘤干细胞特性,在CD90阳性肝癌干细胞中显著下调。3.mi R-589-5p通过与MAP3K8 m RNA的3’-UTR结合,下调MAP3K8的表达来抑制CD90阳性肝癌细胞的肿瘤干细胞特性。4.原发性肝癌中普遍表达CD90,其表达量与mi R-589-5p呈显著负相关。CD90高表达和mi R-589-5p低表达提示预后不良。CD90和mi R-589-5p可作为预测肝癌患者预后的有效指标。