论文部分内容阅读
蛋白质是各种生命功能的真正执行者、直接参与者,在维持细胞平衡和各种细胞活动中发挥着巨大作用。而了解蛋白质与其它小分子如磷脂、脂肪酸的相互作用关系能更深入了解蛋白质在各种生命过程中的作用。许多病变如癌症、老年痴呆症和肌萎缩侧索硬化症跟某些特定新生成蛋白有密切关系。因此在时空上反应新生成蛋白和特定小分子的关系和追踪特定新生成蛋白的分布对理解治疗特定疾病有重大意义。然而,目前的常规荧光成像方法能对新生成蛋白进行较好成像,但很难实现新生成蛋白和其它小分子的同时成像,而且在追踪内源性特定新生成蛋白上取得的进展较少,也存在假阳性信号较多的问题。因此,发展一种能原位同时可视化新生成蛋白和脂类或者可视化特定新生成内源性蛋白的方法显得尤为迫切。基于此,本论文将SLIAC或者click标记技术跟TOF-SIMS或荧光成像技术相结合,构建了2个能同时成像新生成蛋白和脂类小分子的分析体系和1个能成像新生成特定内源性蛋白的系统,主要研究内容如下：1.细胞内新生成蛋白和特定磷脂的同时质谱成像研究结合TOF-SIMS成像和SILAC标记新生成蛋白的优势,通过掺入含’5N的精氨酸和赖氨酸到新合成蛋白中,利用TOF-SIMS检测精氨酸和赖氨酸’5N的特征碎片峰来成像新生成蛋白。我们对精氨酸和赖氨酸在仪器不同模式下的主要特征峰的灵敏度和信噪比进行比较,发现不同的特征峰灵敏度和信噪比差别较大。我们通过检测不同时间段新合成的蛋白及用15N的特征峰与相对应的’4N的特征峰的比值,能对新生成蛋白进行相对定量。由于TOF-SIMS特别适合检测磷脂的一些特征峰,因此我们在成像新生成蛋白的同时还能成像磷脂。此外,还利用氩团簇离子(Ar 3500+ gas cluster ion)溅射细胞,得到细胞的3D成像。我们研究了细胞分裂过程中G1末期到M中期新生成蛋白和特定磷脂分布,发现了蛋白和磷脂在收缩环中分布的差异。因此,该方法为在生物样品中成像新生成蛋白和磷脂提供了新的途径。2.细胞内新生成蛋白和特定脂肪酸的同时质谱成像研究基于click反应构建了一种同时成像细胞内新生成蛋白和特定脂肪酸的新方法。首先加入含叠氮的氨基酸,使其替代甲硫氨酸掺入到新生成的蛋白中,然后通过叠氮与炔基之间的click反应接上溴或者碘原子,利用TOF-SIMS检测溴或者碘的信号来成像新生成蛋白。同时TOF-SIMS对某些特定脂肪酸或者核酸特征峰有较高灵敏度,可以实现新生成蛋白和特定脂肪酸或核酸的同时检测。该方法有望应用于检测细胞的某些特定活动中新生成蛋白和脂肪酸或核酸相互作用的关系。3.细胞内新生成特定蛋白的荧光成像研究基于荧光共振能量转移(FRET)的策略构建了一种成像新生成的特定内源性蛋白的方法：利用click反应在新生成蛋白里接上受体,再通过抗体在特定蛋白上接上供体,通过FRET信号去检测新生成特定蛋白。首先我们发现相比三通道法,光漂白法和FLIM-FRET方法有更高的灵敏度。然后我们应用光漂白法和FLIM-FRET方法在不同的细胞系中检测了新生成的TDP-43、tubulin、Camk2a蛋白。理论上,只要有感兴趣蛋白的抗体,通过这种FRET和FLIM-FRET策略就能研究该新生成蛋白的分布情况。因此,该方法为细胞内追踪新生成特定蛋白合成、转运提供了新的思路,并有望应用于研究各种疾病中相关蛋白。