第一部分T细胞在白血病微泡诱导造血干/祖细胞恶变中的作用目的:微泡(microvesicle,MV)是细胞在激活、损伤或凋亡状态从胞膜释放的双层脂质小囊泡结构,携带有母体细胞的旁分泌信息,通过释放到微环境中或直接与微环境中的细胞融合,来改变受者细胞的生物学行为。我们前期研究发现,慢性粒细胞白血病细胞系K562来源MV包含BCR-ABL1 mRNA及大量的miRNA,能够通过持续诱导供者来源外周血单个核细胞(PBMC),使其中的造血干/祖细胞转化成白血病样细胞。众所周知,动员的供者外周血中不仅含有大量的造血干细胞,更包含有丰富的T淋巴细胞,但是众多的T细胞却无法阻止正常细胞的恶变。本部分拟在前期研究的基础上,明确T细胞在微泡诱导PBMC恶变过程中的作用及变化。方法:采用密度梯度离心法收集K562细胞来源MV;分离供者来源PBMC,分为三份,其中一份使用CD3磁珠抗体去除CD3~+T细胞,将分离后的细胞进行CD3-FITC标记,流式检测分选的纯度及去除量,并将分离得到的CD3~+T细胞加入到另一份PBMC中,剩下的一份作为对照,使用收集的K562-MV对三组细胞进行诱导实验,在诱导第5天开始,每天取少量细胞进行涂片,瑞氏吉姆萨染色,观察细胞形态,判断细胞恶变的时间点;每孔种入相同数目的PBMC,在诱导0、3、7天计数每孔细胞总数;流式检测各时间点淋巴细胞及T细胞亚群比例变化,同时检测CD4~+和CD8~+T细胞表面PD-1表达;在MV诱导PBMC的0、3、7天,使用磁珠分选分离出其中的CD3~+T细胞,PCR检测LAG3、Tim-3 mRNA的表达。结果:通过流式检测我们发现,使用磁珠分选出的CD3~+T细胞能达到98%以上的纯度,但是磁珠分选并不能去除PBMC中所有CD3~+T细胞,而是只能将CD3~+T细胞的比例降低三分之二左右;MV诱导正常PBMC恶变时间在14天左右,但是在去除一部分T细胞后,细胞恶变时间缩短(13.67±0.667 vs 9.167±0.872,P=0.0021),而增加T细胞数量的一组,恶变时间仍然在14天左右(13.67±0.667 vs 14.5±0.764,P=0.43);在诱导过程中,绝对计数发现,细胞总数在持续减少;流式检测发现淋巴细胞比例也持续降低,但CD3~+CD8~+和CD3~+CD4~+T细胞比例在第三天最高,之后逐渐降低;CD4~+和CD8~+T细胞表面PD-1的表达在0、3、7天逐渐升高;0、3、7天分选出的T细胞,进行RT-PCR发现,LAG3和Tim-3 mRNA也持续升高。结论:根据前期研究基础,本部分在MV诱导恶变体系中,去除部分T细胞缩短了恶变时间,而增加T细胞却对恶变时间无明显影响,说明阻止恶变并不单单是T细胞数量的问题,还有可能是T细胞功能发生了变化;在诱导过程中PBMC总数及淋巴细胞总数持续降低的情况下,CD4~+和CD8~+T细胞却在第三天出现一个高峰,说明T细胞在诱导过程中发生了显著变化;PD-1、LAG3和Tim-3是抑制性受体,在T细胞活化时可适当表达升高,以防止T细胞的过度活化,但如果这些抑制性分子持续上调,会导致T细胞功能障碍,在我们实验中,流式及PCR检测均显示抑制性受体诱导过程中持续升高,说明在诱导过程,可能出现了T细胞耗竭。第二部分体内外证实白血病来源微泡诱导T细胞耗竭目的:近年来,免疫治疗疗法取得重大突破,成为肿瘤领域竞相研究的热点。其中T细胞免疫是免疫治疗的主体,嵌合抗原受体T细胞(CAR-T)更是免疫治疗领域的焦点所在。但以T细胞等免疫细胞治疗肿瘤绝非“一劳永逸”,仍存在大量难题亟待基础研究及临床攻坚,T细胞耗竭(T Cell Exhaustion)则是其中的核心问题之一。本部分拟从体内外实验验证不同白血病细胞来源MV能够诱导T细胞耗竭,揭示T细胞耗竭的全新机制。方法:体外建立T细胞诱导体系:培养白血病细胞系K562、KG1a、Jurkat,梯度离心法分离MV;磁珠分选CD3+和CD8+T细胞;重悬MV诱导T细胞,每天两次,取诱导0、3、7天细胞进行一系列检测:CFSE标记检测T细胞增殖;annexin V和PI双标检测T细胞凋亡;胞内染色检测T细胞分泌细胞因子IL-2水平;流式检测T细胞活化指标CD69表达;PCR检测T细胞杀伤因子CD107a表达和CD8+T细胞表面PD-1、Tim-3表达变化;CBA试剂盒检测T细胞培养上清中细胞因子IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、IFN-γ、TNF-α、IL-17a的水平;PCR检测细胞因子IL-2、TGF-β、IFN-γm RNA水平和T细胞耗竭指标PD-1、Tim-3、CTLA-4、LAG3 m RNA水平。建立T细胞耗竭小鼠模型:将Balb/c小鼠分为6组,分别尾静脉注射PBS,尾静脉注射K562细胞,腹腔注射K562-MV,尾静脉注射K562-MV、KG1a-MV、Jurkat-MV,每天注射一次,持续20天,在注射的3、5、7、10、20天分别小鼠内眦静脉取100μl血,标记CD3、CD4、CD8、PD-1、Tim-3流式抗体,检测小鼠T细胞表面PD-1、Tim-3表达水平;注射第7天和20天分别处死一批小鼠,取脾脏和肾脏,比较每组脾脏和肾脏大小;将脾脏进行抗人CD45免疫组化染色,观察每组CD45阳性比例;注射20天后,停止注射MV 15天,处死小鼠,流式检测T细胞表面PD-1、Tim-3表达;比较各组脾脏肾脏大小;抗人CD45免疫组化染色脾脏,观察观察CD45阳性比例;小鼠脾脏提RNA,PCR检测PD-1 m RNA水平。收集各类白血病患者骨髓,磁珠分选CD3+、CD8+T细胞,流式检测T细胞表面PD-1、Tim-3表达;将分离出的T细胞在体外培养7天,流式检测PD-1,Tim-3表达;同时检测患者骨髓分出的单个核细胞中CD4+、CD8+T细胞表面PD-1表达,将骨髓单个核细胞体外培养7天后,再流式检测PD-1、Tim-3表达。结果:在体外诱导体系中,MV持续诱导T细胞0、3、7天,与无MV诱导组相比,T细胞增殖未发生明显变化,且MV诱导组在3天和7天也无明显变化;MV能够诱导T细胞凋亡,在第七天尤为明显;MV诱导T细胞后,第3天T细胞分泌IL-2水平明显较对照组升高,在MV诱导第7天,T细胞分泌IL-2水平明显减少;在第三天T细胞活化指标CD69和T细胞杀伤指标CD107a的表达明显较对照组升高,在第7天这两个指标较第3天明显降低;CD8+T细胞表面PD-1和Tim-3表达持续升高;CBA试剂盒检测MV诱导T细胞培养上清中细胞因子IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、IFN-γ、TNF-α、IL-17a,抑制性细胞因子IL-10第3天低于第7天,其余细胞因子均呈现第3天较第7天升高趋势;PCR结果显示细胞因子IL-2、IFN-γ、TNF-αm RNA水平与上清中细胞因子相同趋势,而抑制性细胞因子TGF-β与IL-10具有相似趋势;T细胞耗竭指标PD-1、Tim-3、CTLA-4、LAG3 m RNA水平在各类MV诱导后呈现持续升高的趋势。在小鼠模型中,MV注射5、7、10、20天,T细胞表面PD-1、Tim-3的表达,注射MV组较对照组明显升高;且在第7天和20天处死的小鼠中发现,处理组较对照组小鼠脾脏明显增大,而肾脏大小无差别;抗人CD45抗体染色发现,处理组CD45表达阳性率明显升高;脾脏及肝脏PCR检测结果提示处理组抑制性受体PD-1、Tim-3、CTLA-4和LAG-3表达水平较对照组升高;有趣的是,注射MV 20天的小鼠停止注射15天后,流式检测发现T细胞表面PD-1、Tim-3表达水平较前降低,且脾脏缩小到与对照组相似大小;抗人CD45免疫组化染色显示CD45阳性比率也明显减少;PCR检测脾脏PD-1水平又恢复到与对照组相同水平。从白血病患者骨髓中分离出的T细胞高表达抑制性受体PD-1、Tim-3,体外培养7天后,耗竭指标明显降低;然而,将白血病患者骨髓单个核细胞在体外培养7天后,耗竭指标PD-1并没有降低,有的反而升高,这说明T细胞在脱离肿瘤微环境时,可逆转其耗竭状态。结论:本部分从体内外证实不同白血病细胞来源MV诱导T细胞耗竭。在MV诱导T细胞耗竭过程中,出现T细胞先活化后失活的状态,第3天T细胞活化指标及杀伤指标明显升高,说明T细胞发生活化,而在第7天,T细胞分泌细胞因子能力降低,且抑制性受体持续升高,说明出现T细胞耗竭状态;小鼠模型进一步证实白血病来源MV能够诱导T细胞耗竭,在外界诱导因素消失的情况下,能够逆转T细胞耗竭状态;临床标本检测证明耗竭的T细胞脱离肿瘤微环境能够逆转T细胞耗竭状态。第三部分MV诱导T细胞耗竭的机制研究目的:T细胞耗竭是指慢性感染和癌症状态下,T细胞出现“疲劳”,逐渐失去细胞毒效应及增殖功能,IFN-γ、TNF-α及IL-2等细胞因子的分泌减少,并表达大量抑制性受体。高表达抑制性受体已被作为T细胞耗竭的标志,靶向抑制PD-1、CTLA-4等也成为解决T细胞耗竭的主流方法,已被广泛用于治疗黑色素瘤、非小细胞肺癌、乳腺癌、头颈癌、肾癌等各类肿瘤。但大量研究已发现,抑制PD-1等抑制性受体并不能完全重塑耗竭T细胞的功能。这说明T细胞耗竭极有可能存在尚未发现但作用关键的重要机制。本部分拟初步探讨MV通过何种途径诱导T细胞耗竭。方法:K562-MV与T细胞共培养后,PCR检测T细胞内BCR-ABL1、mi R-182,、mi R-92a表达水平;共聚焦显微镜观察MV与T细胞共培养后两者融合情况;在MV诱导PBMC过程中,CD3磁珠分选出0、3、7天三个时间点的CD3+T细胞,每个时间点重复三次,提取T细胞RNA,进行表达谱测序。测序结果采用生物信息学分析,获取诱导过程中具有显著性差异的基因,根据转录因子谱及mi RNA靶点预测,构建诱导转化过程中发挥关键作用的前反馈环(FFL);筛选出三个在诱导过程中变化明显的基因SERPINB2、CXCL5、IL-1β;根据课题组前期研究,K562-MV中含有大量mi RNA,其中mi R-182、mi R-126、mi R-16、mi R-21和mi R-92a表达量较高,预测与上述三个基因存在mi RNA-靶基因-转录因子调控环路。在T细胞内共同转染五个mi RNA mimics,检测转染效率,及预测的靶基因SERPINB2、CXCL5、IL-1β表达和耗竭指标PD-1、Tim-3、CTLA-4、LAG-3表达水平;Western blot检测转染mi RNA分子群后NF-κB通路活性。结果:MV与T细胞共培养72h后,T细胞内BCR-ABL1、mi R-182,、mi R-92a表达明显升高,共聚焦显微镜观察发现MV与T细胞发生融合;在MV诱导0、3、7天T细胞转录组测序发现,T细胞发生耗竭前后大量基因表达发生改变,涉及细胞粘附(CXCL16、CXCL5)、炎症活化(NF-κB、NFAT等)、脂质代谢(LGALS1)、溶酶体途径(LYZ)等。SERPINB2、CXCL5、IL-1β呈现先升高后降低的趋势,这与T诱导过程中T细胞先活化后失活相一致;在T细胞内转染mi RNA分子群后,三个靶基因表达下调,耗竭指标PD-1、Tim-3、CTLA-4、LAG-3表达明显上调;转染mi RNA分子群后,胞浆P65水平升高,胞核P65蛋白水平降低,且总蛋白磷酸化P65降低和IκBα升高,说明NF-κB通路失活。结论:MV能够与T细胞融合,传递mi RNA至T细胞,引起T细胞内SERPINB2、CXCL5、IL-1β基因下调,同时NF-κB通路下调,说明MV传递mi RNA分子群至T细胞,持续靶向调控T细胞活化信号网络的多种关键分子,抑制NF-κB等通路活性导致T细胞出现耗竭。