1.背景与目的:龋病是最常见的口腔疾病之一[1]。在美国有近90%的青少年或年轻成人患有,或者曾患有龋病[2]。食物、病原菌、宿主和时间为龋病发生的主要因素[3]。多种细菌、蛋白等在牙齿表面作用一定时间形成生物膜。生物膜结构能够保护内部细菌免受外界刺激的伤害,还能够增强细菌对一般抗菌药物的抵抗能力[4]。因此,对生物膜的控制一直是龋病防治的关键。氟化物的防龋能力是肯定的,但其推广有一定的限制[5]。传统抗生素容易诱使细菌发生突变而产生耐药性。因此,需要研发新型的能够抑制游离或生物膜状态微生物的药物。抗菌肽是近来口腔微生物学研究的热点,抗菌肽因为具有抗菌谱广、无免疫原性等特点,所以极有可能成为一种高效、低毒的临床新型药物[6]。从美洲鲽(Pleuronectes americanus)的表皮中分离出来的α螺旋阳离子抗菌肽pleurocidin,成为近年来研究较多的抗菌肽之一,具有确定的抗菌效果[6,7]。但是pleurocidin的长度为25个氨基酸,过长的氨基酸更加难以渗透进入生物膜内部,而且过长氨基酸应用于临床上也提高了合成成本,因此我们需要开发新的短肽。本研究在pleurocidin活性中心的基础上设计的新型抗菌多肽pm11,并验证其杀菌效果。2.方法:2.1使用二倍稀释法[8]检测pm11对口腔常见微生物的MIC(最小抑菌浓度),然后使用平板涂布法检测MBC(最小杀菌浓度)。2.2使用检测时间杀死曲线(CLSI M26-A)[8]的方法测定高浓度pm11对口腔常见微生物的抗菌作用。2.3通过软琼脂铺板抑菌圈方法进一步直观检测pm11对口腔常见微生物在唾液环境下的抗菌作用。2.4培养细菌生物膜,以PBS处理组为阴性对照,异丙醇处理组为阳性对照,pm11处理组为实验组,使用活菌死菌染色剂(LIVE/DEAD?Bac Light TM Bacterial Viability Kit L-13152,Invitrogen Inc.美国)避光染色后,激光共聚焦(CLSM)观察生物膜。2.5培养细菌悬液,以PBS处理组为阴性对照,pm11处理组为实验组。固定脱水冷冻干燥喷金后使用扫描电子显微镜(SEM)观察pm11的杀菌作用。3.结果:3.1 pm11对8种微生物具有抗菌活性,且抗菌活性相差很大,MIC范围为2-256μg/ml,MBC范围为4->256μg/ml。3.2短期(2h)杀菌动力学结果显示致龋菌随着pm11作用时间的增加,存活细菌数显著下降。3.3溶解在唾液和超纯水中的pm11的抑菌效果并没有统计学差异(P>0.05),而且浓度越大,pm11的杀菌效果越强。3.4 pm11处理组红色死菌数量明显增多,而且死菌的区域有向团聚生物膜内细菌蔓延的趋势。3.5 SEM结果直观地看到pm11作用下的细菌细胞膜表面有明显的孔洞、细胞皱缩、细菌溶胀及细胞裂解或碎片。4.结论:4.1 pm11对悬浮态细菌具有不同的杀菌作用并且呈时间和浓度依赖性。4.2 pm11对细菌生物膜具有一定的抗菌活性。4.3 pm11可能主要通过破坏细菌细胞膜,引起细菌内容物流出,从而导致细菌死亡。