肺癌在我国是最常见的恶性肿瘤,占恶性肿瘤致死率第一位。其中约80%为非小细胞肺癌（non small cell lung cancer,NSCLC）,在 NSCLC 的治疗中,铂类起到非常重要的作用。其中顺铂使用历史最久,最广泛。但它的耐药问题却亟待解决。虽然目前有许多关于顺铂耐药的肺癌组织基因多态性的研究,但是直到现在没有一种遗传变异可以作为临床患者对铂类反应性的准确的预测标记。并且由于肿瘤组织难以获得,大小有限并且有一定的异质性,导致临床应用的局限和困难。所以,我们期望找到一种新的耐药机制和更为有效的生物标志物,为预测和逆转临床顺铂耐药提供更多的方法和途径。有报道指出自噬在肿瘤耐药中发挥作用,但是在肺癌中仍有争议。本课题将从NSCLC细胞株,临床组织、血液标本三个层面上研究自噬在肺癌细胞中对顺铂反应性的影响,并初步探讨肿瘤外泌体中自噬相关微小核糖核酸（microRNA,miRNA）是否具有作为辅助预测NSCLC顺铂疗效的标志物的可能,为进一步临床转化提供理论依据。本研究具体内容包含以下两部分:第一部分:NSCLC基础自噬水平和顺铂疗效的相关性研究目的:检测在NSCLC组织及细胞系中基础自噬的水平,探索其表达水平对肺癌顺铂疗效的临床意义。方法:用免疫组化方法检测经顺铂为主的一线化疗的203例NSCLC病人（88例晚期和115例根治术后）肺癌组织标本中的自噬相关蛋白Atg5和LC3B-Ⅰ的水平。用GraphPad Prism 5.0软件包对203例NSCLC病人的临床病理资料及基础自噬水平进行统计学分析。用蛋白免疫印迹（western blot）方法检测NSCLC细胞系中的自噬相关蛋白LC3B的水平,MTT法检测不同NSCLC细胞系对顺铂的IC50。NSCLC细胞中转染siRNA干扰Atg5基因,慢病毒干扰Bedin-1基因,MTT实验检测敲低自噬相关基因后,细胞对顺铂敏感性的变化。结果:1、88例晚期病人,按照非疾病进展时间（Progression-free survival,PFS）分成顺铂耐受组（PFS ≤ 6 M,n=46）和顺铂敏感组（PFS>6 M,n=42）,耐受性NSCLC组织中自噬相关蛋白Atg5表达水平明显高于敏感性NSCLC组织,而自噬负相关蛋白LC3B-Ⅰ明显低于敏感性NSCLC组织。2、晚期NSCLC病人肺癌组织中,Atg5的表达水平与PFS成负相关,LC3B-Ⅰ与PFS成正相关。3、将88例晚期NSCLC病人按癌组织中Atg5和LC3B-Ⅰ的表达水平分为高表达组和低表达组,结果表明:低LC3B-Ⅰ、高Atg5表达组病人（n=44）与高LC3B-Ⅰ、低Atg5表达组病人（n=44）相比更容易耐药（高LC3B-Ⅰ表达组中位PFS为7.5个月,而低LC3B-Ⅰ表达组中位PFS为4个月;高Atg5表达组中位无病生存期为5个月,而低Atg5表达组中位无病生存期为6个月）。4、在115例根治术后NSCLC病人中,高LC3B-Ⅰ表达组病人（n=58）与低表达组病人（n=57）相比不易复发;高Atg5表达组更易复发（高LC3B-Ⅰ表达组中位无疾病生存时间（disease-free survival,DFS）为22个月,而低LC3B-I表达组中位DFS为6个月;高Atg5表达组中位DFS为8个月,而低Atg5表达组中位DFS为22个月）。5、不同的NSCLC细胞系LC3B-Ⅱ/LC3B-Ⅰ蛋白比例不同并且相对LC3B-Ⅱ蛋白表达量高即基础自噬水平高的细胞系对顺铂的IC50比较高,敏感性差。6、沉默NSCLC细胞系中的自噬相关基因Atg5和Beclin-1后,它们对顺铂的反应性得以提高。结论:NSCLC对顺铂的反应性和肿瘤的基础自噬水平相关,且自噬水平越高,对顺铂化疗的反应性越低,疗效越差。抑制自噬水平可以增强对顺铂的敏感性,提高疗效。基础自噬水平有可能作为预测NSCLC的顺铂疗效的生物学指标。第二部分:NSCLC外泌体miRNA与顺铂疗效的关系目的:探索NSCLC来源的外泌体miRNA是否可以预测NSCLC对顺铂反应性,并分析其机制是否和自噬相关。方法:提取晚期NSCLC病人血清外泌体RNA,行小非编码RNA（small non-coding RNA,sRNA）测序分析顺铂敏感病人（PFS>6 M,n=10）和顺铂耐受病人（PFS≤ 6 M,n=10）差异性表达的miRNA。对变化的miRNA进行生物信息学分析,包括聚类分析,基因本体（Gene Ontology,GO）分析,基于KEGG（the Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes）数据库的通路分析等。提取170例晚期NSCLC病人血清和不同的NSCLC细胞系的外泌体总RNA,使用实时荧光定量逆转录-聚合酶链反应（Quantitative Real-time PCR,qRT-PCR）方法验证、筛选差异性表达的miRNA。分析外泌体miRNA和顺铂治疗疗效的关系。过表达或沉默相关miRNA,MTT实验检测对顺铂反应性的变化,Western blot检测NSCLC中自噬通路蛋白LC3B,p62,Atg5,p-mTOR,p-AKT的变化。通过靶基因预测软件TargetScan分析筛选miRNA的自噬相关靶基因及其结合位点。分别构建野生型（WT）,对其2个结合位点序列以其互补碱基进行替换构建突变序列1（MUT 1）,突变序列2（MUT 2）以及2个结合位点均替换的双突变序列（MUT 1+2）的pMIR-REPORTM质粒。应用构建的荧光素酶报告基因行靶基因验证。细胞转染及qRT-PCR方法验证其是否可以调控靶基因的表达。用免疫组化方法检测79例晚期NSCLC组织中相关自噬靶基因蛋白的表达,分析其蛋白表达量与病人PFS的关系,从而在临床组织样本中进一步验证miRNA调控靶基因,影响NSCLC对顺铂敏感性。结果:1、晚期NSCLC血清外泌体sRNA测序结果提示:sRNA组成主要为miRNA,顺铂耐受性病人和顺铂敏感性病人有224个差异性表达的miRNA,162个在敏感病人中高表达,其中153个表达差异大于2倍;剩余62个在耐受病人中高表达,其中54个表达差异大于2倍。2、GO分析及KEGG通路分析提示:差异性表达的miRNA参与了多种肿瘤相关的生物学过程包括细胞粘附和细胞增殖凋亡等,也包括顺铂可能的耐药机制——自噬通路。3、选取6个差异性表达最大的miRNA在170例晚期NSCLC病人血清外泌体中用qRT-PCR进一步验证sRNA测序的结果,结果其中有3个miRNA（hsa-miR-425-3p,hsa-miR-146a-5p,hsa-miR-4755-5p）在 76 例顺铂耐受性病和94例顺铂敏感性病人中的表达有统计学差异。4、为了探究病人血清外泌体hsa-miR-425-3p表达量和顺铂疗效的关系,我们按绝对浓度中位值将170例晚期NSCLC病人分成高表达组和低表达组比较其PFS的差异。结果表明低表达组比高表达组有更长的PFS（高表达组中位PFS为4个月,而低表达组中位PFS为8个月）。5、不同NSCLC细胞来源的外泌体hsa-miR-425-3p也有差异。顺铂低反应性NSCLC细胞系外泌体中的hsa-miR-425-3p的表达量明显高于顺铂高反应性NSCLC细胞。6、过表达miR-425-3p后,高反应性NSCLC细胞对顺铂的反应性降低,顺铂的杀细胞作用减弱;相反抑制miR-425-3p后,低反应性NSCLC细胞对顺铂的反应性增高,顺铂的杀细胞作用增强。7、过表达miR-425-3p后,顺铂高反应性NSCLC自噬相关蛋白LC3B-Ⅱ,Atg5的表达增多,底物p62下降;负调控分子p-AKT,p-mTOR蛋白表达减少,自噬活性增强;抑制miR-425-3p后,顺自噬相关蛋白的表达减少,自噬活性减弱。8、靶基因预测软件TargetScan提示miR-425-3p结合于AKT1基因的3’UTR区。在AKT1的3’UTR区101-124序列和783-802序列分别有2个miR-425-3p的结合位点。9、荧光素酶报告实验中,转染了 WT或MUT 2序列的质粒,靶基因的荧光活性显著减低,而转染了 MUT 1+2或MUT 1序列的质粒,荧光活性没有明显变化。说明miR-425-3p确实靶向基因AKT1,并结合于其3’UTR区的101-124的结合位点1,起到抑制AKT1表达的作用。10、过表达NSCLC细胞中的miR-425-3p,结果AKT1的mRNA和蛋白表达水平均下降;转染inhibitor,即抑制NSCLC细胞中miR425-3p的表达,结果AKT1的mRNA和蛋白量均增高。11、晚期NSCLC病人肺癌组织的免疫组化实验结果显示:顺铂敏感组比顺铂耐受组有更高水平的AKT1蛋白的表达。按79例晚期病人肺癌组织中自噬相关蛋白AKT1的IOD中位值分成高表达组和低表达组,AKT1高表达组的PFS长于低表达组（高AKT1表达组中位PFS为6个月,而低AKT1表达组中位PFS为3个月）。结论:晚期NSCLC病人血清循环外泌体中miR-425-3p靶向AKT1基因,抑制肿瘤自噬水平,可能作为一种生物标志物提示病人对顺铂的反应性,预测预后从而指导顺铂的用药。