南方水稻黑条矮缩病毒(Southern rice black-streaked dwarf virus,SRBSDV)和水稻锯齿叶矮缩病毒(Rice ragged stunt virus,RRSV)同属于呼肠孤病毒科,前者属于斐济病毒属,由白背飞虱以持久性增殖型方式传播,后者属于水稻病毒属,由褐飞虱以持久性增殖型方式传播。SRBSDV是2001年于广东省阳西县首次发现、2008年鉴定的水稻病毒新种,近年来迅速扩散至越南北部及我国南部广大稻区,成为生产上最主要的病害之一。RRSV在中国自1978年首次发现以来,一直零星发生,仅个别年份和田块发生较重。然而近年来伴随SRBSDV的大面积爆发,RRSV在中国南部呈加重为害的趋势,田间出现大量的SRBSDV和RRSV复合侵染病株。复合侵染的病毒可能发生协生作用,通过增加寄主体内病毒含量,加重病株症状表现,提高介体传毒效率,对农业生产造成更为严重危害。为了揭示SRBSDV和RRSV复合侵染时两种病毒的互作,本文展开了一系列研究,主要结果如下:1.复合侵染的水稻植株内SRBSDV和RRSV发生了协生作用,病害症状加剧,病毒含量提高。症状观察表明,复合侵染导致水稻植株显症时间提前,接毒后第15 d,50%复合侵染植株上部新生叶片就出现叶尖扭曲症状,而SRBSDV和RRSV单独侵染的植株在20d时才观察到该症状。在接种后9d、15d和20d时,复合侵染植株的高度分别仅为健康植株的87.8%、50.8%和32.8%,是SRBSDV单独侵染时的90.6%、83.3%和75.5%,是RRSV单独侵染时的92.4%、67.7%和58.4%,复合侵染造成的植株矮缩显著重于单独侵染。RT-qPCR对病株中两病毒所有基因表达水平的检测结果表明,与单独侵染相比,早(9d)、中(15d)和后(20d)期3个病程点复合侵染植株体内SRBSDV P5-1、P7-1、P9-1和P10以及RRSV P3、P6、P8和P10表达水量均显著增加。在这些上调表达的病毒基因中,除壳蛋白基因外,均为病毒复制工厂(病毒基质)组份相关基因,暗示复合侵染时两种病毒的复制能力受到了相互促进。2.白背飞虱和褐飞虱从复合侵染植株上获毒效率显著提高。与单独侵染植株相比,在病程第9d、15d和20d的植株上饲毒24 h,白背飞虱和褐飞虱从复合侵染植株上的获毒效率分别提高了7.4%、27.8%、21.2%和11.5%、19.3%、15.3%。表明SRBSDV和RRSV的协生同时增加了两种病毒介体的获毒效率,因此,SRBSDV的暴发不但直接对水稻生产构成威胁,而且通过与RRSV协生,提高两病毒介体获毒能力,加剧两病毒的流行。3.两病毒复合侵染导致水稻更严重的细胞病理学变化。透射电镜观察表明,无论是病程早(9d)、中(15d)和晚(20d)期,srbsdv和rrsv复合侵染均比单独侵染引致更严重的细胞病理学变化,主要表现在病株上部第一平展叶韧皮部细胞内的病毒粒体数量和病毒基质数量均显著增多;叶肉细胞中叶绿体肿大更为严重,线粒体数量和嗜锇颗粒数量均显著增加,脂滴增大更为明显,反映了两病毒协生需消耗更多能量,寄主脂类代谢严重受阻,细胞器受损更为严重。4.两病毒复合侵染对水稻rna沉默途径关键蛋白基因表达模式的影响明显不同于单独侵染。采用rt-qpcr分析了感病水稻植株8个dcl(osdcls),19个ago(osagos)以及5个rdr(osrdrs)的表达水平,结果表明,两病毒单独及复合侵染均会导致osago11及osago18的表达上调,其中复合侵染时osago11的上调幅度显著大于srbsdv单独侵染,在病程9d、15d和20d时,分别是srbsdv单独侵染时的1.26倍、1.55倍和1.83倍;但与rrsv单独侵染时表达量差异不显著。osago18的表达,在复合侵染与两病毒单独侵染之间不存在显著差异。两病毒单独侵染对8个osdcls的表达均不造成显著影响,但复合侵染时有时3个osdcls(osdcl2a、osdcl3b和osdcl4)的表达被显著上调。两种病毒单独及复合侵染均使osrdr1及osrdr4表达上调,而复合侵染时两者的上调幅度显著升高,在病程9d、15d和20d时,复合侵染植株中osrdr1的表达分别是srbsdv单独侵染时的7.81、9.00和9.98倍,是rrsv单独侵染时的8.35、9.69和10.14倍;osrdr4的表达分别是srbsdv单独侵染时的4.56、9.11和10.76倍,是rrsv单独侵染时的4.82、5.56和5.83倍。表明srbsdv和rrsv协生深刻影响了水稻rna沉默路径。5.两病毒rna沉默抑制子的功能具有加性效应。利用农杆菌共浸润的方法,以转gfp基因本生烟16c为材料,分析了srbsdv的沉默抑制子sp6和rrsv的沉默抑制子rp6单独及复合作用对gfp沉默抑制的活性。注射后1d,sp6和rp6单独处理分别仅19.83%和30.42%的浸润区域观察到微弱的绿色荧光,而两者复合处理则有高达89.02%的浸润区域观察到明显的绿色荧光;同时,复合处理浸润区域gfpmrna表达水平显著高于sp6和rp6单独处理浸润区域,分别是后两者的3.36倍和3.18倍。注射后2d,各处理的绿色荧光信号均达到最强,复合浸润区域gfpmrna表达量分别是sp6和rp6单独浸润区域的1.12倍和1.14倍,但差异不显著。注射后3d,sp6和rp6单独浸润的区域绿色荧光信号开始减弱,而两者复合浸润区域仍保持明显的绿色荧光;同时,复合浸润区域gfpmrna表达量分别是sp6和rp6单独浸润区域的2.04倍和1.39倍,差异显著。结果表明,RP6比SP6抑制效果更强,而两病毒沉默抑制子的共同作用,可显著提早抑制时间,增加抑制强度,延长抑制维持期,这极可能是两病毒表现协生的机理之一。以上研究结果,清晰地解释了田间大量发生SRBSDV和RRSV复合侵染的现象,并且提示两病毒的流行具有相互促进的可能性,同时为深入研究病毒协生分子机理提供了新的线索。