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CRISPR/Cas系统是细菌和古细菌在不断进化的过程中产生的适应性的免疫防御机制,用来保护自身的基因组免受外源核酸如噬菌体、病毒等的干扰和破坏。CRISPR/Cas系统作为一套适应性免疫系统,应用CRISPR RNA(crRNA)以碱基互补的形式引导Cas蛋白识别入侵的外源基因组,并对其DNA进行剪切。根据Cas蛋白的序列和结构将CRISPR/Cas系统分为I型、II型和III型。其中I型和III型系统都需要多个Cas蛋白原件,而II型仅仅需要Cas9蛋白。II型CRISPR/Cas系统(即CRISPR/Cas9系统)已被发展成为一套理想的程序化的基因编辑工具。本文的主要目的是针对Foxp3基因设计靶位点gRNA,利用CRISPR/Cas9系统构建靶向修饰载体系统,对Foxp3基因位点进行编辑,然后探讨Foxp3的生物学功能,利用CRISPR将Foxp3基因敲除后,以Foxp3敲除细胞为研究对象,进行各项生物学特性检测。我们还将此技术应用在肿瘤小鼠模型中,以期降低肿瘤细胞中的Foxp3基因的表达,阻止Treg细胞的产生,抑制肿瘤细胞在小鼠体内的生长。本文使用的主要方法和结果:1、利用UCSC网站确定小鼠Foxp3基因外显子,使用CRISPR Design检索得到潜在靶位点,通过BLAST确定最终靶向序列。2、将合成的靶向序列引物与核酸内切酶BbsⅠ消化过的载体质粒PX458连接后,通过酶切电泳检测和通用引物测序确定靶向载体质粒构建成功。3、利用电穿孔转染技术成功转染小鼠脾细胞,并通过荧光显微镜检测到载体质粒携带的GFP标签的表达。4、利用RT-PCR技术以及流式检测Foxp3胞内染色分别在mRNA和蛋白水平鉴定Foxp3基因靶向敲除载体质粒的转染降低了小鼠脾细胞中Foxp3的表达。5、利用静脉注射及活体基因导入技术成功将靶向敲除载体质粒转染至肿瘤小鼠体内,并通过解剖确定靶向敲除载体质粒的转染有效地降低了荷瘤小鼠的肿瘤数目及荷瘤率。6、通过对靶向载体质粒转染的小鼠进行脾细胞细胞计数、血细胞分析及流式细胞术检测淋巴细胞内细胞因子,确定了小鼠体内Foxp3的表达降低对脾细胞数目、淋巴细胞比例及各种细胞因子的影响。本文的主要结论:1、在第一部分实验中,我们构建并筛选鉴定了靶向小鼠Foxp3基因的CRISPR/Cas9载体。2、在第二部分实验中,载体质粒在小鼠脾细胞中表达,检测显示我们在上一部分构建的靶向敲除载体在细胞中发挥作用,降低了Foxp3的表达。3、在第三部分实验中,靶向敲除载体可以在小鼠体内发挥作用,阻止Treg细胞的产生。检测显示靶向敲除载体的体内转染使小鼠血液淋巴细胞百分率明显回升,同时使血清IL-2、IFN-γ含量明显回升,辅助型T细胞比例增加,抑制小鼠体内肿瘤的生长和发展。