糖尿病是严重影响人类身体健康的重大疾病之一。2型糖尿病是最主要的糖尿病类型,占患病总数的90%以上。2型糖尿病的发病与生活水平和饮食结构有密切关系。高脂饮食和肥胖是诱发2型糖尿病的主要因素。近三十多年来,由于我国经济的快速发展和人民生活水平的提高,2型糖尿病的发病率迅速攀升,患病率从不到1%,到现在超高10%,患病人数已超过1亿。糖尿病可引起心脑血管疾病、肾功能衰竭、周围神经病变及眼底病变等多种并发症。糖尿病的防治成为当今医药领域最为关注的热点之一。2型糖尿病的突出表现是胰岛素抵抗,血糖进行性升高和糖耐量下降。现有的降糖药物虽然有一定的降糖或改善胰岛素抵抗的疗效,但是都无法恢复胰岛p细胞功能。即使接受系统、持续的治疗,胰岛功能也总是在不断地衰退。因此,这些降糖药物都只能延缓病情进展,无法彻底修复胰岛功能,使病情得到有效控制。胰高血糖素样肽-1(glucagon-like peptide1, GLP-1)是一种由肠上皮L细胞分泌的短肽激素,属于肠促胰素的一种。现已证明GLP-1具有刺激胰岛p细胞增殖和胰岛素分泌,抑制β细胞凋亡,提高肌肉、肝脏细胞对胰岛素的敏感性。另外,它还可以通过调控食欲、抑制能量吸收和动员脂肪等多方面的作用来降低血糖和改善胰岛素抵抗。GLP-1类似肽——利拉鲁肽(liraglutide)和艾塞那肽(exenatide或extendin-4, EX4)现已成为肥胖和糖尿病防治的新药。但是,目前GLP-1类似肽都是采用化学合成方法进行生产,离不开多肽的分离纯化工艺,只能注射途径给药,不能口服,存在生产工艺复杂、成本高和使用不便的缺点。迫切地需要改进GLP-1类似肽的生产和给药方式,降低药物副作用。双歧杆菌是哺乳动物体内最安全、最有益于身体健康的益生菌群之一,是人体肠道的第一批居民,是婴幼儿肠道中主要菌群。双歧杆菌不仅具有改善肠道微生态环境、抑制致病菌生长,促进营养吸收的作用,而且还具有免疫调理、分解有毒的代谢中间产物和预防肿瘤发生的作用。双歧杆菌作为食品、药品已经有几百年的历史,其安全性也得到充分验证。以双歧杆菌为宿主菌来表达功能多肽是最安全、最简便的途径,有利于长期用药。因此,我们利用双歧杆菌来表达GLP-1类似肽,并探讨其降血糖和改善胰岛素抵抗的疗效。在已建立的双歧杆菌表达系统的基础上,我们构建了GLP-1改构肽GLP-1(8G)和类似肽EX4双歧杆菌表达载体,转化获得,携带有GLP-1(8G)和EX4基因的转化双歧杆菌。体外分析双歧杆菌表达的GLP-1(8G)和EX4的表达表达规律及生物学活性；体内对高脂高糖饮食和链脲佐菌素(STZ)诱导的2型糖尿病模型小鼠的治疗实验观测其降糖的疗效,并探讨其分子作用机制。具体的实验设计方案如下：(1)选择以往实验已构建好的大肠杆菌-双歧杆菌穿梭质粒载体pBBADs-EV与化学合成的GLP-1改构肽GLP-1(8G)和类似肽EX4基因片段,构建并测序鉴定pBBADs-GLP-1(8G)与pBBADs-EX4穿梭质粒,将pBBADs-GLP-1(8G)与pBBADs-EX4质粒电转化到长双歧杆菌(NCC2705)中,厌氧培养48h后,筛选出阳性克隆菌落。GLP-1(8G)转化双歧杆菌命名为BL-GLP-1(8G); EX4转化双歧杆菌命名为BL-EX4;空载体pBBADs-EV转化双歧杆菌命名为BL-EV。把转化双歧杆菌接种到含有氨苄青霉素的MRS培养基当中,以0.2%L-阿拉伯糖(L-arabinose, L-Arb)诱导表达12h、24h、36h后,分别用ELISA和Western blot法验证转基因双歧杆菌中的GLP-1(8G)与EX4蛋白表达水平,并选择最佳的诱导表达时间。(2)在生长状态良好的INS-1细胞(ratinsulinoma cell)中加入含有BL-GLP-1(8G)与BL-EX4诱导表达后的培养上清,用CCK-8细胞毒性试剂盒进行细胞毒性检测。(3) BL-GLP-1(8G)与BL-EX4分泌蛋白的体外生物学活性试验：将转化的双歧杆菌以0.2%L-阿拉伯糖(L-arabinose, L-Arb)诱导培养的上清培养INS-1细胞24h,48h后,运用ELISA测定培养液中胰岛素含量的变化情况。(4) BL-GLP-1(8G)与BL-EX4分泌蛋白的模型动物治疗功能性试验：运用高脂高糖喂食C57BL/6J小鼠后,腹腔注射链脲佐菌素(STZ),成功造成2型糖尿病模型后,分组后给予小鼠灌胃0.2%L-阿拉伯糖(L-arabinose, L-Arb)诱导表达后的BL-GLP-1(8G)与BL-EX4连续治疗28天,以BL-EV组为阳性对照。①2型糖尿病小鼠的造模与判定：用高糖高脂饲料饲养小鼠48天后,以10mg/kg链脲佐菌素(STZ)的剂量腹腔注射,禁食12h后,剪鼠尾取血,使用血糖仪测定血糖,并达到了糖尿病小鼠非空腹血糖的成膜标准(11.1mmol/L)者被初步判定为2型糖尿病小鼠,并继续高脂高糖喂食；②灌胃0.2%L-阿拉伯糖(L-arabinose, L-Arb)诱导表达后的BL-GLP-1(8G)与BL-EX4连续治疗28天,摘眼球取血,2000rpm低温离心10min,取血浆保存于4℃冰箱,丙氨酸氨基转移酶(ALT)、尿素氮(BUN)、肌酐(CR)、甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白(LDL)、极低密度脂蛋白(VLDL)等生化指标采用全自动生化检测仪进行检测；③处理小鼠时,取各组新鲜的肝组织,迅速放入液氮。从液氮中取出的肝组织,剪取各组组织100mg左右,放入研磨皿中研磨,加入Triol提取组织中的RNA,立即逆转录成DNA,运用荧光定量PCR的方法检测Adiponectin (脂联素)、Adiponectin acceptor(脂联素受体)和Resistin (抵抗素)在肝组织中的表达水平；油红O染色法分析脂肪肝病变程度；④各取一部分肝脏组织,4%多聚甲醛溶液固定,常规石蜡包埋,进行HE染色对其肝组织的形态进行分析；⑤取各组胰岛部分,4%多聚甲醛固定,常规石蜡包埋,切成10μm后,进行免疫组化分析其经过治疗后的p胰岛的形态与分泌情况变化。(5)验证GLP-1受体在小鼠结肠与INS-1细胞中存在：①剪取正常小鼠部分结肠,超声裂解,低温离心,取上清贮存在-20℃备用,运用Western blot方法鉴定；②用正常培养基培养INS-1细胞48h后,超声裂解后,低温离心,运用Western blot方法鉴定；③剪取正常小鼠部分结肠,4%多聚甲醛固定,常规石蜡包埋,进行免疫组化处理鉴定；④取正常小鼠部分结肠,常规石蜡包埋,切成10μm后,按组织免疫荧光方法处理,封片后,运用共聚照显微镜(confocal图像)405/488nm波长下拍照鉴定；⑤在6孔板中,常规培养基培养到状态良好时,按照细胞免疫荧光方法处理,运用共聚照显微镜(confocal图像)在405/488nm波长下拍照鉴定；研究结果显示：(1)在长双歧杆菌(NCC2705)中,成功构建了能够分泌GLP-1改构肽GLP-1(8G)和类似肽EX4的双歧杆菌BL-GLP-1(8G)与BL-EX4传递体；经过挑选鉴定的BL-GLP-1(8G)和BL-EX4转基因双歧杆菌在生物与形态学上并没有显著的改变。经过L-阿拉伯糖体外诱导后,其分泌的蛋白,能够在转基因双歧杆菌的上清与菌体中检测出来,测定最佳的诱导表达式时间是24h。(2) BL-GLP-1(8G)与BL-EX4经过0.2%L-Ara诱导表达后的培养上清对INS-1细胞有增殖作用,且ELISA检测其细胞培养上清,证明其诱导后的培养上清胰岛素的量显著升高。(3)空腹血糖、口服葡萄糖糖耐量实验中,经过灌胃BL-GLP-1(8G)和BL-EX4的T2DM的小鼠,相对灌胃BL-EV的T2DM小鼠来说有显著效果(P<0.05)。(4)对于血浆的生化检测,与BL-EV组相比,灌胃BL-GLP-1(8G)治疗的小鼠的VLDL、TG、LDL都有显著的变化。(5)与BL-EV组相比,经过灌胃BL-GLP-1(8G)和BL-EX4治疗28天后,ELISA法证明血清中的Adiponectin(脂联素)水平有显著性升高。(6)运用Western blot,共聚照显微镜(confocal)与免疫组化的方法,证明INS-1细胞与C57BL/6J小鼠结肠上确实存在相同的GLP-1R受体。总之,我们成功构建了携带有GLP-1(8G)和EX4的双歧杆菌表达载体,并筛选获得目的基因转化双歧杆菌；在基因转化双歧杆菌的菌体与培养上清能够检测到GLP-1(8G)和EX4的表达；体外实验证明转化双歧杆菌的GLP-1(8G)和EX4表达产物能促进INS-1细胞增殖,并刺激胰岛素分泌；体内对高脂高糖饮食和STZ诱导的2型糖尿病模型小鼠的治疗实验证实,口服GLP-1(8G)和EX4转化双歧杆菌可以观测其降糖的疗效,并探讨其分子作用机制。相对于目前在市面上的GLP-1类似物注射剂,转基因BL-GLP-1(8G)口BL-EX4具备了体内诱导表达,经肠上受体直接吸收,减少肾毒性的发生；生产工艺简单,不需任何提取纯化即可服用,降低了生产纯化成本,提高社会效益；只需通过口服等方式,简便、无毒、无痛,可以明显地降低疼痛感,增强其适应性；在体内诱导表达,降低其半衰期短的缺点,可不问断发挥作用,治疗效果显著。结合动物实验的疗效结果来看,可预想到未来可对人类的2型糖尿病的治疗,具有十分具大的发展潜力。因此,BL-GLP-1(8G)与BL-EX4有望成为拥有GLP-1类似物对糖尿病的治疗作用的一种新剂型,并且能够调节病人肠道微生物的新一代益生菌。