研究背景与目的：阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease, AD)俗称老年痴呆症,是一种多发于老年期或老年前以进行性认知障碍为主要特征的中枢神经退行性疾病,由德国神经精神病学家Alois Alzheimer于1907年首次报道,并以其名字命名该疾病。AD的临床症状主要表现为记忆力下降、行为异常、语言障碍和人格、运动能力的变化。p-淀粉样蛋白(β-Amyloid, Aβ)假说是目前最为公认的病因学假说,一直以来科学家期望通过抑制脑内Aβ的合成或清除Ap的方法来开发新的AD治疗药物均未成功,提示Aβ也许并不是最理想的抗AD药物靶标。近年来,随着对AD发病机制的深入研究,大部分学者认为简单的神经递质和受体理论不能完全解释AD的发病机制,也无从正确地指引新的抗AD药物的开发和疾病治疗。AD的研究重点逐步从神经递质和受体理论的研究深入到基因分子水平,尤其是脑内第二信使系统、转录因子和突触蛋白的表达等成为研究的热点。磷酸二酯酶4 (Phosphodiesterase 4, PDE4)是环磷酸腺苷(cyclic adenosine monophosphate, cAMP)的特异性水解酶之一,根据基因型的不同分为PDE4A、 PDE4B、PDE4C和PDE4D四个亚型,可进一步细分为25种亚亚型。PDE4作为抑郁症、阿尔茨海默病和慢性阻塞性肺病等潜在治疗靶点已被研究二十余年,但由于其高发的恶心呕吐副作用至今仍未有被批准用于精神类、神经退行性疾病的PDE4抑制剂。PDE4抑制剂可通过抑制PDE4对cAMP的水解作用,使细胞内cAMP水平升高,激活cAMP依赖性蛋白激酶A (protein kinase A, PKA),促使cAMP反应元件结合蛋白(cAMP response element binding protein, CREB)的第133位丝氨酸(ser133)磷酸化,即激活cAMP/PKA/CREB信号通路而发挥抗抑郁和促认知作用。本课题组通过对现有PDE4抑制剂的结构以及PDE4晶体结构进行解析,同时结合咯利普兰发生不良反应的可能机制,认为寻找有效透过血脑屏障且对PDE4D有较好的选择性和抑制活性的化合物,可能是发现安全有效PDE4抑制剂的途径之一。前期研究显示FFPM对PDE4D2的选择性较PDE2A3、PDE5A1、PDE7A1和PDE9A2要高达2000倍,显示出较好PDE4D抑制作用,对脂多糖诱导的急性肺损伤及炎症反应具有很好的改善和调节作用。然而关于其在中枢神经系统中研究,尤其是AD,至今仍未有报道。因此,本研究将从PDE4酶活性抑制、药效学、药代动力学、作用机制、以及化合物致呕吐不良反应等多方面对FFPM进行系统评价,以期发现安全有效的PDE4抑制剂为防治阿尔茨海默病提供理论支持。研究方法：(1)采用部分纯化的人重组PDE4CAT、PDE4A4、PDE4B2、 PDE4C1及PDE4D4的cDNA表达蛋白,检测多个浓度的FFPM对上述重组酶的抑制作用,并同时以PDE4抑制剂Rolipram作为对照药,得到酶活性抑制曲线并计算FFPM的IC50值,确证FFPM是否为特异性PDE4抑制剂；采用氢溴酸东莨菪碱诱导C57小鼠AD模型,评价FFPM (0.06,0.12,0.24,0.48 mg/kg)对AD小鼠在Morris水迷宫获得性实验和探索性实验中改善认知功能的作用；超高效液相色谱-串联质谱法测定C57小鼠血浆和脑组织中FFPM的浓度,研究FFPM在小鼠体内的药物动力学过程及血脑组织分布特点,获得主要的药动学参数Tmax、Cmax、t1/2、MRT0-t、AUC0-t和AUC0-∞,以证明FFPM可有效地透过血脑屏障；采用氯胺酮和赛拉嗪联合麻醉小鼠替代模型,0.50 mg/kg FFPM灌胃给药,观察其对小鼠麻醉苏醒潜伏期,并以PDE4抑制剂Rolipram作为对照药物,评价FFPM对小鼠的致呕吐潜能；进一步使用非啮齿类动物比格犬灌胃给予不同剂量(0.25 mg/kg,0.50 mg/kg,1.0 mg/kg) FFPM和对照药Rolipram (1.0 mg/kg),观察给药后比格犬是否出现恶心呕吐副作用；(2) APPswe/PSlde9 (APP/PS1)转基因小鼠经尾组织提取DNA、RT-PCR扩增反应及琼脂糖凝胶电泳进行基因型鉴定；采用行为学评价模型新物体识别实验、Morris水迷宫实验和跳台被动回避实验评价4、6、8月龄APP/PS1转基因小鼠与相同月龄野生型小鼠的学习记忆功能的差别,以期用于后续为FFPM药效学评价提供可靠的干预时间点；采用免疫组化方法和刚果红染色方法检测各组小鼠脑内小胶质细胞活化标记物CD68、刚果红斑块以及两者共定位的分布情况；采用ELISA法检测6、8月龄小鼠脑内可溶性Aβ40和Aβ42、不溶性Aβ40和Aβ42的水平,检测8月龄小鼠脑内肿瘤坏死因子-α(Tumor necrosis factor TNF-a)和白介素-1β (Interleukin-1β, IL-1β)的释放水平；(3)7月龄APP/PS1转基因小鼠连续21天FFPM (0.125,0.25,0.50 mg/kg)灌胃给药,以Rolipram (0.50 mg/kg)作为阳性对照药,采用自主活动实验、新物体识别实验、Morris水迷宫实验和跳台被动回避实验,评价FFPM对8月龄APP/PS1转基因小鼠(即连续给药后月龄)的自主活动和学习记忆能力的影响：采用ELISA法检测各组小鼠海马内cAMP的含量；采用免疫印迹检测各组小鼠海马内磷酸化PKA (p-PKA)、磷酸化CREB (p-CREB)、CREB、脑源性神经营养因子(Brain-derived neurotrophic factor, BDNF、Synapsin-1、PSD95、NF-κB p65、 Histone H3、诱导型一氧化氮合酶(Inducible nitric oxide synthase, iNOS)、环氧合酶-2(Cyclooxygenase-2, COX-2)、TNF-α、IL-1β和GAPDH的蛋白表达变化；采用Real time PCR检测各组小鼠海马内BDNFmRNA水平；采用免疫荧光检测各组小鼠海马及海马各亚区内BDNF、NeuN以及两者共定位的荧光活性；(4)MTT法检测FFPM (0.625-80 μM)和Aβ42(1.25～20 μM)分别对BV-2小胶质细胞细胞活性的影响：采用ELISA法检测FFPM (2.5,5.0,10 μM)和Rolipram (20 μM)对Aβ42(2.5μM)刺激BV-2细胞,以及当加入PKA抑制剂H89阻断,24小时后细胞上清液中TNF-α、IL-1β和IL-6相应的分泌水平的影响；采用免疫印迹法检测2.5μMAβ42处理BV-2细胞0.5,1,2,4小时,10μM FFPM预处理1小时后与Aβ42共孵育1小时以及加入PKA抑制剂H89阻断,细胞内p-PKA、p-CREB和GAPDH的蛋白表达变化；采用免疫细胞化学方法检测FFPM预处理1小时后与Aβ4M2共孵育1小时,细胞内NF-κBp65的核转移情况；采用免疫印迹进一步明确经FFPM和(或)Aβ42处理后BV-2细胞核内外NF-κB p65、细胞内p-ERK1/2的蛋白表达变化；收集Aβ42刺激或(和)FFPM(和)或H89处理BV-2细胞后的上清液作为条件培养基,与SH-SY5Y细胞共培养后,采用免疫印迹法检测各组细胞内Synapsin-1和PSD95的蛋白表达变化。研究结果：(1)FFPM对PDE4CAT、PDE4A、PDE4B2、PDE4C1和PDE4D4的抑制IC50值分别为56.2 nM、31 nM、42.9 nM、230 nM和11.8 nM,而Rolipram对PDE4CAT、PDE4A4、PDE4B2、PDE4C1和PDE4D4的抑制IC5o值分别2480nM、159 nM、783 nM、118 nM和260 nM;FFPM可改善氢溴酸东莨菪碱诱导的小鼠痴呆症状,表现为缩短小鼠在Morris水迷宫获得性实验找到隐藏平台的潜伏期和显著性增加小鼠在探索性实验原有平台象限的探索时间,其中FFPM在0.12,0.24,0.48 mg/kg的作用效果均具有统计学意义；药代动力学的结果显示,C57小鼠经灌胃给予0.5 mg/kg FFPM后,血浆Tmx为2 h,Cmax为9.723±2.994ng/ml,t1/2为1.487±0.198 h,MRT0-t为：2.816±0.121 h；用梯形法计算,AUC0-t分别为32.5 ±0.959 ng/ml·min,AUC0-∞分别为33.91±10.675 ng/ml·min;从血浆-大脑浓度-时间分布曲线发现,小鼠口服给予FFPM后,15 min即可在脑组织中检测到FFPM,在2小时达到药物峰值,表明FFPM能有效透过小鼠血脑屏障；赛拉嗪/氯胺酮联合麻醉C57小鼠的结果显示,与溶剂组比较,0.50 mg/kg Rolipram明显缩短小鼠麻醉持续时间,而0.5 mg/kg FFPM则无明显差别,表明FFPM对小鼠的致呕吐潜能低；比格犬的实验结果进一步显示,1.0 mg/kgRolipram灌胃给药在9.60±1.373 min即产生明显呕吐反应,而FFPM (0.25,0.50,1.0 mg/kg)和溶剂在120 min的观察期内,所有比格犬均未出现呕吐作用,提示FFPM对比格犬致呕吐潜能极低。(2)所有小鼠经基因型鉴定后,同时具有APP、PS1突变基因扩增条带的即为APP/PS1转基因小鼠,相反,无阳性扩增条带的即为野生型小鼠；新物体识别实验结果显示,各月龄小鼠对相同物体的识别指数并无明显区别,而对新物体的识别指数仅有8月龄APP/PS1转基因小鼠较野生型小鼠出现显著性下降,4、6月龄小鼠则无明显差异；Morris水迷宫获得性实验结果显示,各月龄小鼠随着学习时间的增加,找到隐藏平台的潜伏期逐渐缩短,其中8月龄的APP/PS1转基因小鼠的逃避潜伏期较野生型小鼠要长,差异具有统计学意义;水迷宫探索性实验显示,与野生型小鼠比较,6、8月龄APP/PS1转基因小鼠在原有平台象限的探索时间显著性减少；跳台被动回避实验结果显示,各月龄小鼠跳下平台的潜伏期逐渐缩短,与野生型小鼠比较,6、8月龄APP/PS1转基因小鼠显著性减少了在平台停留的时间；此外,6、8月龄APP/PS1转基因小鼠脑内Aβ水平一定程度地增加,其中不溶性Aβ40、Aβ42的增加十分明显；免疫组化结果和刚果红染色显示,8月龄APP/PS1转基因小鼠脑内小胶质细胞被激活,表现为CD68和刚果红斑块的表达增加,而且刚果红斑块周围聚集有大量活化的小胶质细胞；ELISA结果显示,与野生型小鼠比较,8月龄APP/PS1转基因小鼠脑内TNF-α和IL-1p分泌显著性增加。(3)连续21天灌胃给予PDE4抑制剂FFPM、Rolipram或溶剂后,各组小鼠的自主活动无明显差异,说明慢性给药对小鼠的自主活动能力无影响；与野生型小鼠比较,0.50 mg/kg FFPM可显著性提高APP/PS1转基因小鼠在新物体识别实验中对新物体的识别指数。Morris水迷宫结果显示,FFPM连续给药具有缩短各组小鼠在获得性实验找到隐藏平台的潜伏期,其中在第4、5天,与APP/PS1转基因小鼠溶剂处理组比较,FFPM缩短效果显著；在探索性实验中,FFPM可显著性增加APP/PS1转基因小鼠在原有平台象限的游泳路程和探索时间,其中剂量0.25 mg/kg和0.50 mg/kg的剂量效应具有统计学意义。跳台实验结果显示,与APP/PS1转基因小鼠溶剂处理组比较,FFPM能延长APP/PS1转基因小鼠在平台停留时间,表现为跳台潜伏期明显增长,其中0.25 mg/kg和0.50mg/kg效果显著。FFPM连续给药可逆转APP/PS1转基因海马内cAMP含量的减少,同时增加海马内p-PKA、p-CREB和BDNF、Synapsin-1和PSD95的蛋白表达而不影响CREB和GAPDH的水平。与Western blotting的结果相似,免疫荧光双标结果表明FFPM可逆转APP/PS1转基因BDNF和NeuN的免疫荧光活性表达的下调,即FFPM增加BDNF的表达可能起到促进神经元存活的作用。此外,Real time PCR的结果显示,FFPM能增加APP/PS1转基因小鼠海马BDNF mRNA水平。免疫印迹的结果证明,FFPM连续给药还可以减少APP/PS1转基因海马核内NF-κB p65及其介导的炎症因子如iNOS、COX-2、TNF-a和IL-1p的蛋白表达。(4)MTT结果显示,与正常对照组对比,FFPM在检测浓度范围(0.625～80μM)内对BV-2小胶质细胞的活性不产生明显影响；而Aβ42在5-20μM对BV-2细胞则产生显著性毒性,细胞存活率下降至80%以下。ELISA结果显示,FFPM处理1小时后,各浓度(2.5,5.0,10μM)均能不同程度地抑制由2.5μM Aβ42引起的BV-2细胞炎症因子的释放。其中,FFPM在剂量为10μM时对TNF-α[L-1β和IL-6的抑制效果最为显著,均具有统计学意义,并且作用强于对照药Rolipram。当预处理PKA抑制剂H89,10 μM FFPM介导的抗炎作用(TNF-α、[L-1β和IL-6的分泌)的抑制作用则被阻断。Aβ42与BV-2细胞孵育1h即可显著性减少p-PKA、p-CREB的蛋白表达,且随时间逐渐增加,两者的表达减少更为明显,而10μMFFPM预处理1h可逆转p-PKA、p-CREB的表达减少。而PKA抑制剂H89能有效阻断FFPM对BV-2细胞p-PKA、p-CREB的蛋白表达上调。免疫荧光细胞化学结果显示,2.5μM Aβ42处理BV-2细胞1h可诱导NF-κB p65由胞浆向细胞核内转移,而10μM FFPM能抑制NF-κB p65的核转移；免疫印迹的结果进一步显示,FFPM可显著性逆转Aβ42引起的BV-2细胞胞浆NF-κB p65的减少和细胞核内NF-κB p65的增加。Aβ42孵育1 h,可使BV-2细胞p-ERK1/2的蛋白表达明显减少,然而FFPM预处理对Aβ42引起的p-ERK1/2表达减少并无显著性作用。此外,FFPM能逆转Aβ42激活的BV-2细胞条件培养基对SH-SY5Y细胞突触蛋白Synapsin-1和PSD95的减少。结论：FFPM为特异性的PDE4抑制剂,可有效透过血脑屏障,对PDE4CAT、 PDE4A、PDE4B和PDE4D的抑制作用要明显优于第一代PDE4抑制剂Rolipram,具有改善氢溴酸东莨菪碱模型小鼠和APP/PS1转基因小鼠学习记忆损伤的作用。更重要的是FFPM对小鼠和比格犬未表现出致呕吐反应。FFPM增强AD认知功能主要是激活cAMP/PKA/CREB信号通路,介导BDNF的转录和翻译和增加突触相关蛋白Synapsin-1、PSD95的蛋白表达水平以及抑制NF-κB核转移介导的炎症反应,从而防止脑内神经元和突触的丢失。此外,FFPM还可通过抑制Aβ诱导小胶质细胞NF-κB的核转移,调控Aβ介导的炎症反应对神经元和突触的损伤。