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目的:乙型肝炎病毒（HBV）是一种小病毒基因组的部分双链DNA病毒,HBV导致的慢性乙肝仍然是一个全球公共卫生问题,即使得益于乙肝疫苗和抗病毒药物的临床应用,目前全世界仍超过2亿人患有慢性乙肝,乙肝的长期发展又会导致肝硬化和肝癌的发生,对人类的身体健康造成严重威胁。Id1蛋白是分化抑制因子（Id1-4）中的一员,属于bHLH转录因子家族,由于Id1缺少了与DNA结合的碱性（basic）区,导致Id1蛋白通过与其他bHLH转录因子结合形成异源二聚体从而抑制了bHLH转录因子对下游靶基因的调控。Id1的功能主要与促进细胞增殖和抑制分化相关,许多参与调控细胞增殖的基因,同样参与HBV的表达调控,此外如E2F4转录因子也属于H（helix）超家族,已被报道与Id2存在相互作用,而该因子在HBV的复制调控中的作用还未见报道。因此本文重点研究了宿主因子Id1及相互作用的转录因子E2F4在HBV复制和转录过程中的调控作用及其分子机制,其研究结果进一步丰富宿主因子对HBV的调控网络,并有助于基于该机制研发新的抗病毒药物。方法:1,在临床样本中,运用qRT-PCR和western blot实验分析HBV相关的肝细胞肝癌中癌旁与肿瘤的HBV pgRNA的转录水平以及Id1和HBV核心蛋白的表达水平。2,在细胞水平和动物水平,同样应用western blot实验比较HBV复制阳性和HBV复制阴性的细胞以及HBV转基因小鼠和非转基因小鼠中Id1的表达水平。3,进一步应用western blot分析HBV四种蛋白（HBc/p/s/x）对Id1的影响以及研究HBV在HepG2-NTCP感染模型中对Id1的作用。4,运用Id1Ad感染HBV复制的细胞（HepG2.2.15,HepAD38和HepG2-HBV1.1）实现Id1蛋白的过表达,分别应用Southern blot实验,ELISA和western blot检测HBV DNA,HBeAg和HBc水平变化;应用qPCR检测HepG2.2.15细胞中HBV cccDNA和pgRNA的变化。5,运用pCDNA3.1-Id1转染HBV感染HepG2-NTCP模型,应用qPCR检测其中HBV DNA的变化。6,应用靶向Id1的shRNA1/2干扰序列降低HepG2.2.15和HepG2-HBV1.1细胞中的Id1水平,分别应用Southern blot实验,ELISA和western blot检测HBV DNA,HBeAg和HBc水平变化。7,通过尾静脉注射Id1Ad感染HBV-TgM,在体内小鼠过表达Id1,同样应用Southern blot和qPCR检测小鼠肝脏组织中HBV DNA的变化,应用western blot和IHC检测肝组织细胞Id1和HBc蛋白的变化,采用ELISA检小鼠血清中HBeAg的变化。8,通过qRT-PCR和western blot筛查Id1过表达对调控HBV的经典宿主因子的影响。9,通过qRT-PCR筛查HBV复制的细胞中的mRNA水平发生改变的HLH转录因子。10,构建潜在的发生变化的HLH因子的过表达质粒,通过筛查它们对HBV Cp启动子的影响,特别是E2F4发挥了对Cp启动子活性显著的促进作用。11,进一步研究比较了E2F4在HBV复制的HepG2.2.15,HepAD38和HepG2-HBV1.1细胞中以及25对临床样本中癌组织和癌旁组织的各自表达情况。12,利用E2F4Ad感染HepG2.2.15和HepG2-NTCP细胞过表达E2F4,应用qPCR检测其中HBV DNA和pgRNA的变化。13,免疫荧光试验,免疫共沉淀实验和GST-pulldown实验检测E2F4与Id1之间的相互作用。14,胞浆胞核蛋白分离联合western blot试验检测HBV复制和Id1对细胞中E2F4的核内外分布的影响。15,HepG2.2.15分别在过表达E2F4和干扰Id1以及过表达Id1和干扰E2F4之后,Southern blot检测HBV DNA的复制水平。16,ChIP实验检测Cp启动子是否招募E2F4蛋白,Id1对该招募的影响。17,应用体外EMSA实验检测Cp启动子和E2F4蛋白是否存在直接相互作用。18,根据E2F4的二级结构和识别位点规律,生物信息学进行分析E2F4在Cp启动子上存在的潜在识别位点,构建相应的启动子突变体,应用荧光素酶活性实验验证潜在位点的缺失是否导致E2F4对HBV的调控受阻。19,体外SPR实验和ITC实验检测E2F4截短蛋白和Cp启动子DNA链的相互结合作用。20,根据潜在位点构建相应的HBV1.3倍体突变体,通过ChIP实验检测突变的Cp启动子对E2F4的招募情况。21,在Huh7细胞中转染HBV1.3倍体突变体,qPCR检测该细胞分别感染E2F4Ad和Id1Ad后HBV DNA的变化,ELISA检测细胞上清中HBeAg的变化。22,生物信息学比对分析常见的四种HBV基因型（Gt A/B/C/D）中E2F4潜在识别位点的保守性,进而应用southern blot和qPCR检测E2F4和Id1对四种HBV复制调控作用的普适性。结果:1,在25对HBV相关的肝癌与癌旁组织样本中,癌旁样本的pgRNA整体表达水平大约是肝癌组织的两倍（P<0.05）,其中20对样本的HBc的蛋白水平在癌旁组织中明显高于癌组织,有18对样本的Id1的蛋白表达水平在肝癌组织中明显高于癌旁。2,在HBV稳定复制的细胞和HBV瞬时转染的细胞中Id1 mRNA和蛋白水平均明显低于非HBV复制的对照肝癌细胞。3,在HBV感染细胞模型中,HBV的感染导致Id1的蛋白水平明显减少,过表达HBV相关蛋白HBp和L-HBs同样导致Id1蛋白水平的降低,HBV转基因小鼠的肝组织中,Id1蛋白水平也显著低于普通C57小鼠。4,Id1过表达可显著抑制HBV复制细胞（HepG2.2.15,HepAD38和HepG2-HBV1.1细胞）中HBV DNA复制中间体,pgRNA和HBc的表达水平,上清中HBeAg的分泌水平（P<0.01）,此外过表达Id1也显著下调HepG2.2.15细胞中HBV cccDNA的复制水平和Cp启动子的活性（P<0.05）。5,下调Id1的表达可显著促进HBV复制细胞（HepG2.2.15和HepG2-HBV1.1细胞）中HBV DNA复制中间体和HBc的表达水平,上清中HBeAg的分泌水平（P<0.05）。6,Id1过表达可显著抑制HBV转基因小鼠肝组织中HBV DNA复制水平和HBc的表达水平,也导致血清HBeAg分泌水平的显著下降（P<0.05）。7,在HepG2.2.15细胞中,Id1过表达没有导致经典的HBV调控因子发生明显变化,但HBV的复制导致4种HLH因子mRNA（E2F4,TCF3,E40和USF1）发生显著上调和2种HLH因子（Clock和HIF1α）的显著下调。8,E2F4过表达可以显著促进HBV Cp启动子活性和上调HBV pgRNA,HBV DNA的复制。9,在HBV复制的细胞中E2F4蛋白水平明显高于对照肝癌细胞;在HBV相关的肝癌临床样本中,E2F4的整体蛋白水平在癌旁组织中明显高于癌组织（P<0.05）。10,通过IP和GST-pulldown实验表明E2F4和Id1存在相互作用,Id1的过表达减弱了HBV复制引起的p130和E2F4的核转移。11,过表达E2F4可以进一步促进干扰Id1导致HBV DNA的上调,相反过表达Id1并没有显著抑制干扰E2F4导致HBV DNA的下调。12,ChIP实验证实E2F4能被Cp启动子招募,Id1的过表达同样也阻止了Cp启动子对E2F4的招募作用。13,EMSA实验中,随着E2F4截短蛋白(E2F41-180)的增加,Cp启动子的迁移速率明显下降,并且Cp冷探针可以竞争结合E2F4截短蛋白。14,生物信息学表明E2F4在Cp上存在潜在的识别位点5’-1758TTAAAGGTC1766-3’,该位点的缺失导致E2F4对HBV Cp启动子活性的促进作用消失;在相应的HBV1.3突变体（HBV1.3 mut2.3）中,E2F4和Id1都失去了对HBV的调控作用。15,SPR和ITC实验表明包含5’-1758TTAAAGGTC1766-3’的Cp2短链可以直接与E2F4的DNA识别区域相互结合。16,进步分析发现5’-1758TTAAAGGTC1766-3’在HBV Gt A/B/C/D基因型中高度保守,并且E2F4和Id1对这四种基因型的HBV的调控具有普适性。结论:在本研究中,我们阐明了Id1及其相互作用的转录因子E2F4在HBV复制和转录中的协同调控作用。研究结果显示,无论是在HBV复制背景下的细胞水平还是组织水平中,Id1表达水平均显著下调,而E2F4表达水平则显著上调;E2F4可以通过上调HBV Cp启动子活性从而促进HBV复制和相应的转录;上游Id1分子则通过与E2F4相互作用抑制其核内转移,导致HBV的复制和转录受抑制;5’-1758TTAAAGGTC1766-3’是E2F4在Cp启动子上的直接识别位点,在HBV A/B/C/D四种基因型中高度保守,是Id1和E2F4实现对四种基因型HBV调控的基础。我们的研究进一步完善了宿主因子对HBV的调控网络,为研发新的抗病毒策略提供了新的思路。