研究目的在2019年国家癌症中心发布的最新癌症报告中显示,乳腺癌在中国女性发病前10位癌症构成中仍位居首位,乳腺癌严重威胁着妇女的健康。化疗一直是治疗乳腺癌患者的主要手段。临床上,常用药物联合策略以增加化疗药物的抗肿瘤效果。而理想的药物联合是指在提高杀伤肿瘤细胞能力的前提下,剂量低且没有明显的毒性作用。然而,目前如此理想的组合尚不多见。组蛋白去乙酰化酶抑制剂(Histone Deacetylase Inhibitors,HDACi)中的一种代表性药物,丙戊酸(Valproic Acid,VPA)在其治疗癫痫病的血药安全剂量条件下(300-800μM)不但能够抑制多种乳腺肿瘤细胞的生长,还能增强核苷酸还原酶抑制剂(Ribonucleotide Reductase Inhibitors,RRi)类化疗药物羟基脲(Hydroxyurea,HU)杀伤白血病、头颈部肿瘤细胞以及乳腺肿瘤细胞的作用[1,2]。鉴于VPA在发挥作用时所需剂量大且毒副作用强,因此迫切需要开发高效低毒的VPA衍生物。2-己基-4-戊炔酸(2-hexyl-4-pentynoic acid,HPTA)为一种VPA 衍生物,也能抑制组蛋白去乙酰化酶(Histone Deacetylase,HDAC)活性,其影响HDAC活性的IC50剂量显著低于VPA,且无明显的肝肾损害作用,功能强于VPA[3-5]。但是HPTA是否也具有强于VPA的抗肿瘤功效以及对HU增敏作用尚未见报道。此外,在HU所致的DNA复制阻滞损伤中,高度磷酸化的DNA复制蛋白A2(Replication Protein A2-hyperphosphorylation,RPA2p)介导的同源重组(Homologous Recombination,HR)分子机制(RPA2p-HR)可特异地参与这种损伤的修复过程[6]。并且在这一过程中,RPA2p与Rad51共同作用调节体外细胞的HR活性。因此,本课题探索VPA的衍生物HPTA是否与VPA相似,也具有增加HU对乳腺癌细胞的杀伤作用,以及其作用的分子机制是否与RPA2p-HR修复通路有关。目的在于发现更高效低毒的化疗药物增敏剂,并且为HDACi和RRi两类药物联合应用于乳腺肿瘤的临床精准治疗提供可靠的实验依据和理论指导。研究方法1.MTT实验检测HPTA和VPA同剂量下对HU抑制肿瘤细胞增殖的影响选取处于生长对数期的MCF7、EUFA423细胞接种于96孔板,设置组别:对照组,VPA组(15μM VPA单独处理24h),HPTA组(15μM HPTA单独处理24h),HU 组(2mM HU 单独处理 18h),HU+VPA 组(15μM VPA 预处理 24h后联合2mM HU处理18h),HU+HPTA组(15μM HPTA预处理24h后联合2mM HU处理18h)。相应药物处理结束后,酶标仪490nm&532nm波长下分别检测各组吸光度值,取平均值进行比较。平均值反应该处理组乳腺癌细胞的增殖情况。2.细胞克隆形成实验比较HP,TA和VPA对乳腺癌细胞存活的影响选取处于对数生长期的MCF7、EUFA423细胞接种到p60培养皿中。每组设置三个平行样,分组为:对照组,VPA组(500μMVPA单独处理24h),HPTA组(15μM HPTA 单独处理 24h),HU 组(2mM HU 单独处理 18h),HU+VPA组(500μM VPA 预处理 24h 后联合 2mM HU 处理 18h),HU+HPTA 组(15μM HPTA预处理24h后联合2mM HU处理18h)。各组相应药物处理结束后,更换新鲜DMEM培养基(含10%GST+1%PS),培养箱中培养14天(期间不要进行移动),直至形成克隆终止培养,计算克隆形成率。3.细胞核DNA双链断裂损伤的检测彗星实验检测:选取处于对数生长期的乳腺癌细胞,细胞分组:对照组,HPTA 组(15μM HPTA 单独处理 24h),HU 组(2mM HU 单独处理 18h),HU+HPTA组(15μM HPTA预处理24h后联合2mM HU处理18h),相应药物处理结束后,制成单细胞悬液,进行中性彗星和碱性彗星实验。分析细胞核内DNA损伤。免疫荧光与免疫印迹实验检测:药物处理结束后,每一组的细胞用免疫荧光和免疫印迹实验分别检测γH2AX,53BP1焦点形成情况和蛋白的表达。每一组γH2AX,53BP1焦点和蛋白的表达反应DNADSBs的差异。4.流式细胞术检测HPTA对细胞HR修复效率的影响。选取处于对数生长期,表达带有绿色荧光蛋白标记的同源重组底物的pDR-GFP的MCF7细胞。进行相应的药物处理以获得单细胞悬液,用流式细胞仪检测各处理组细胞的HR修复效率。5.HR修复关键蛋白RPA2-p和Rad51表达的检测选取处于对数生长期的细胞,药物处理结束后,通过免疫印迹和免疫荧光实验检测各组细胞中RPA2-p和Rad51蛋白的焦点形成情况及蛋白表达情况。6.RPA2-p和Rad51之间相互作用关系的检测为确定RPA2-p与Rad51蛋白之间的关系,通过免疫共沉淀实验(Co-Immunoprecipitation,Co-IP),观察两种蛋白是否共存于同一蛋白化合物。7.建立一对稳定表达野生型RPA2、突变型RPA2的MCF7细胞系对外源性的野生型RPA2蛋白进行突变,突变后的RPA2不能正常进行蛋白的磷酸化功能,获得外源性的突变型RPA2。然后,将外源性的野生型和突变型RPA2分别转染入正常的MCF7细胞中,再用shRPA2敲除细胞内内源性的RPA2。然后筛选出稳定表达野生型RPA2和突变型RPA2的细胞培养。8.大鼠原发性乳腺癌原代培养细胞的获取将二甲基苯蒽(DMBA)粉末溶于少量的甲苯中,再将其溶于预热的植物油中。选用50日龄,性成熟,SD雌性大鼠,将20mg DMBA经口一次性灌胃。饲养SD大鼠约90天,被诱导出原发性乳腺肿瘤。无菌条件下,取大鼠原发性乳腺肿瘤组织,按照常规组织切块法剪碎后,进行原代细胞培养。并且,将取出的部分肿瘤组织进行HE染色,鉴定肿瘤的性质。研究结果1.低剂量的HPTA可增加乳腺肿瘤细胞对HU的敏感性MTT实验结果显示,单独的15μM HPTA药物处理后抑制MCF7细胞的生长(P<0.05),而单独的15μM VPA对细胞生长没有明显影响(P>0.05)。与单独的HU处理相比,15μM HPTA联合HU可以进一步提高肿瘤细胞的杀伤能力(P<0.05),15μM VPA则不同(P>0.05)。EUFA423细胞的MTT实验结果同样证实,15μM HPTA可进一步提高HU对肿瘤细胞的杀伤能力,15μM VPA并不能明显提高HU对肿瘤细胞的杀伤作用。以上结果确认低剂量15μM HPTA可以增加乳腺肿瘤细胞对HU的敏感性,而15μMVPA对细胞的存活率却没有明显影响。相同剂量条件下HPTA 比VPA具有更敏感,杀伤肿瘤细胞的效果更高效。细胞克隆形成实验结果进一步表明,与对照组相比,单独用500μM VPA,15μM HPTA处理24h的MCF7细胞的存活率分别降低至78.28%(P>0.05),67.72%(P>0.05)。2mMHU 处理 18h 的细胞存活率降至 37.49%(P<0.01)。2mMHU和500μMVPA联合作用细胞,细胞存活率降低至11.72%(P<0.01),2mMHU和15pM HPTA联合作用组的细胞生存率降低至19.37%。两个联合处理组的细胞存活率显示出相似的变化趋势,且不存在统计学差异。乳腺癌细胞系EUFA423克隆形成实验测定的结果表明,与对照组相比,用2 mMHU处理18h的细胞存活率降低至61.43%(P<0.01)。对于500μMVPA、15μM HPTA与HU联合作用组,其细胞存活率分别下降至51.60%、55.34%,15μM HPTA和500μMVPA对EUFA423细胞存活率的影响与MCF7细胞相似。表明HPTA和HU组合对两种肿瘤细胞均具有联合杀伤作用,15μM HPTA与500μM VPA具有相似的增加乳腺肿瘤细胞对HU敏感性的作用。2.低剂量的HPTA增强乳腺癌细胞中HU诱导的DNA双链断裂损伤中性彗星和碱性彗星实验结果均显示,与对照组相比,HPTA单独处理组的细胞DNA拖尾尾距轻微增加(P<0.05),HU单独处理组的细胞DNA拖尾尾距明显增加(P<0.01),HPTA与HU联合处理组的细胞DNA拖尾尾距增加最为明显,为四组中最长(P<0.05)。免疫荧光结果显示,MCF7细胞中,对照组中有少量细胞含有γH2AX焦点。与对照组相比,HPTA 组含γH2AX焦点形成的细胞阳性率增加到13.07%(P<0.05),而在HU组则显着增加到35.10%(P<0.05)。重要的是,对于HPTA与HU联合处理组细胞,具有γH2AX焦点细胞阳性率增加到52.27%(P<0.01)。在EUFA423细胞中,与对照组相比,15μMHPTA引起γH2AX焦点形成的增加。在HPTA与HU联合处理组中,具有γH2AX焦点的细胞阳性率高于其他各个组(P<0.01)。DNA DSBs的另一标志物53BP1蛋白,也观察到类似的结果:在MCF7和EUFA423细胞中,经HU处理后,含有53BP1焦点的细胞阳性率有所升高(P<0.01),HPTA与HU联合处理组,含有53BP1焦点的细胞阳性率进一步显著增加(P<0.01)。免疫印迹结果显示在MCF7和EUFA423细胞中,检测到对照组细胞中γH2AX表达水平低,经HPTA处理的细胞中仅积累了少量的DNA DSBs。单独HU处理后,细胞中γH2AX蛋白的表达量明显增加(P<0.01)。在此基础上,HPTA与HU联合作用进一步增强细胞中γH2AX的表达水平(P<0.01)。并且在MCF7和EUFA423细胞中,联合组53BP1蛋白的表达水平也明显高于其他的单独处理组(P<0.01)。3.HPTA抑制HU诱导的DNA复制阻滞后的HR活性利用PDR-GFP/MCF7细胞,流式细胞术检测HR效率。结果表明,对照组HR效率为60×10-6,HPTA作用后,HR修复效率为65×10-6(P>0.05)。然而,HU作用后,HR修复效率显著提高至100×10-6(P<0.01)。HPTA与HU联合处理组的HR修复效率与单独HU处理相比,显著降低至66×10-6(P<0.01),说明在HU所诱导的复制阻滞中,HPTA能够抑制乳腺癌细胞的HR修复功能。4.在HU诱导的DNA复制阻滞修复中,HPTA抑制RPA2-p、Rad51的功能。通过免疫印迹实验检测MCF7和EUFA423两种肿瘤细胞中各处理组RPA2p蛋白表达情况。结果发现,单独HPTA处理组能使RPA2-p蛋白表达强度轻微升高(MCF7:0.42;EUFA423:0.32);单独HU组能使RPA2-p蛋白表达强度明显升高(MCF7:0.53;EUFA423:0.44);HPTA 和 HU 联合处理使 RPA2-p 蛋白表达强度明显降低(MCF7:0.22;EUFA423:0.33)。通过免疫荧光实验检测两种细胞中表达RPA2-p焦点的细胞阳性率,在各处理组中也观察到相同的变化趋势。免疫印迹实验检测各处理组中细胞Rad51蛋白表达水平,结果显示,在MCF7细胞中HU单独处理仅能使Rad51蛋白表达水平轻微增加(1.53),HPTA与HU联合作用后可使Rad51蛋白表达水平降低(1.25,P<0.01)。在EUFA423细胞中,与单独HU处理组的Rad51蛋白表达水平相比(0.90),HPTA与HU联合作用使Rad51蛋白表达水平降低(0.78;P<0.05)。进一步免疫荧光实验结果显示,在MCF7细胞中,与对照组相比,单独HU处理组,含Rad51焦点的细胞阳性率显著升高至33.45%(P<0.05),与单独HU处理组比较,HPTA和HU联合处理组,含Rad51焦点的细胞阳性率显著降低至19.25%(P<0.01)。在EUFA423细胞中各处理组也得到相同的变化趋势。5.在HU诱导的DNA复制阻滞修复中的关键蛋白RPA2-p和Rad51之间存在相互作用免疫共沉淀(Co-IP)实验结果显示,RPA2-p和Rad51两种蛋白存在于同一蛋白质复合物沉淀中,两种蛋白之间存在相互作用。6.HPTA对经HU处理的表达缺陷RPA2细胞的存活的影响通过免疫印迹实验观察到,经HU处理后,mutRPA2细胞中RPA2-p蛋白的表达量与wtRPA2细胞相比,出现明显显著降低,表明成功建立了突变型-RPA2细胞系。克隆形成实验结果显示,单独HPTA处理组并未显着降低配对细胞的存活率(P>0.05)。在单独HU处理之后,wt-RPA2细胞存活率降低至38.75%,mutRPA2细胞存活率则显著降低至22.89%(P<0.01)。与wt-RPA2细胞相比,mutRPA2细胞对HU处理更为敏感(P<0.01)。而在HPTA和HU联合处理组,wt-RPA2细胞存活率降低至18.20%,mutRPA2细胞存活率降低至13.60%,两种细胞存活率无明显的统计学差异(P>0.05)。以上结果进一步证实,HPTA可以在HU诱导的复制停滞期间通过破坏RPA2-p介导的HR修复途径导致细胞死亡7.HPTA联合HU对DMBA诱导的大鼠乳腺癌组织原代培养细胞的影响首先将取得肿瘤组织做成石蜡切片,通过苏木精-伊红(HE)染色观察组织的病理形态结构,经HE染色后观察后证实为大鼠乳腺癌组织。免疫荧光实验检测不同处理对原代培养细胞核内γH2AX焦点形成的影响,实验结果显示,对照组中含有γH2AX焦点形成的细胞较少,单独HPTA处理使表达γH2AX焦点形成的细胞阳性率轻微升高,单独HU可以使含有γH2AX焦点的细胞阳性率明显升高至33.87%,将2mM HU和15μM HPTA联合作用使具有γH2AX焦点形成的细胞阳性率显著增加至43.98%(P<0.01)。免疫荧光实验检测每组中表达与复制叉阻滞的HR修复机制密切相关的修复蛋白RPA2-p和Rad51在细胞内焦点形成情况。实验结果显示,与对照组相比,HU处理使含RPA2-p焦点的细胞阳性率显著增加至40.50%(P<0.05),而HPTA和HU联合组中表达RPA2-p焦点的细胞阳性率显著降低至34.87%(P<0.05)。另外细胞核内Rad51焦点形成,与单独HU处理组中表达Rad51焦点的细胞阳性率32.30%相比,HPTA和HU联合处理组中表达Rad51焦点的细胞阳性率明显降低为 27.00%(P<0.05)。研究结论1.通过两种肿瘤细胞系和DMBA诱导的大鼠乳腺癌组织原代培养的肿瘤细胞的研究体系,首次发现低剂量15μM HPTA在增强HU诱导的DNA双链断裂损伤以及增加HU对乳腺癌细胞杀伤作用的敏感性方面,与500μM VPA具有相似的作用,这说明HPTA在杀伤肿瘤细胞方面可能比VPA更有效。2.低剂量的HPTA抑制RPA2-p-Rad51介导的HR通路,以达到增加乳腺癌细胞对HU的敏感性。