L-苏氨酸基因工程菌的改造及发酵过程的优化

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L-苏氨酸是人体所必须的八种氨基酸之一,具有独特的生理功能,在食品、医药、化妆品、饲料等多个行业有较广泛的应用。本论文首先对菌种进行了改造,探究了磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PEPC)过表达对L-苏氨酸发酵的影响。然后对大肠杆菌产生L-苏氨酸的发酵过程进行了优化,探究了甜菜碱、B族维生素等不同发酵促进剂对L-苏氨酸发酵的影响。同时分析了添加甜菜碱对L-苏氨酸发酵的代谢流分布的影响。最后探究了细胞循环发酵对L-苏氨酸发酵的影响。本论文所进行的发酵实验是在实验室5L发酵罐中完成的。主要研究内容和结果如下:(1)将过表达pep C基因的质粒p JL225-9导入到E.coli JLTHR菌株,并进行发酵。发酵30h,产量达到111.2g/L,比E.coli JLTHR产量提高2.8%。代谢流分析结果表明通过过表达pep C基因,对菌种的代谢途径的代谢流量进行重新分配。其中在GLC6P节点处,流向HMP途径代谢流量提高了22%,流向EMP途径代谢流量降低了7.5%。在PEP节点处,E.coli JLTHR p JL225-9的代谢流量流向草酰乙酸回补途径提高了4%。(2)通过添加sigma无水甜菜碱、国产无水甜菜碱以及去除了硬脂酸钙的国产无水甜菜碱等三种不同类型的无水甜菜碱探究了其对L-苏氨酸发酵的影响。结果表明,去除了硬脂酸钙的国产无水甜菜碱对L-苏氨酸发酵的提升效果最显著,产量达到119.3g/L,与对照组比较提高7.3%。此外,通过添加不同浓度的甜菜碱盐酸盐和甜菜碱磷酸盐探究了甜菜碱盐类类型和浓度对L-苏氨酸发酵的影响,发酵30h结果表明:甜菜碱盐酸盐在浓度为2g/L的添加量下,L-苏氨酸的产量最高,达到了127.3g/L,与对照组比较提高14.5%;甜菜碱磷酸盐在添加浓度为2g/L的条件下,大肠杆菌的OD600nm最高,达到了63.4,与对照组比较提高了15.3%。甜菜碱含有三个活性甲基,氯化胆碱和甲硫氨酸同样含有活性甲基,在L-苏氨酸合成方面有促进作用。实验表明添加氯化胆碱L-苏氨酸产量为119.3g/L,与对照组比较相等。添加甲硫氨酸进行L-苏氨酸发酵,产量为118.4g/L,与无水甜菜碱效果相似。(3)探究甜菜碱对L-苏氨酸菌种代谢流分布的影响。构建L-苏氨酸菌株的代谢网络,根据代谢流分析理论,使用MATLAB软件线性规划得到L-苏氨酸菌株在发酵中后期的代谢流量的分配。通过代谢流分析,得出葡萄糖在EMP、HMP以及TCA循环中代谢流量分配情况,并确定关键节点GLC6P、PEP和-KG。实验结果表明在节点GLC6P处,添加甜菜碱发酵液后,细胞内葡萄糖流向HMP途径的代谢流量比不添加甜菜碱提高了57.3%。在节点PEP处,添加甜菜碱中细胞中的草酰乙酸(OAA)代谢流比未添加甜菜碱菌体中的OAA的代谢流,提高了10.1%,流向TCA途径的代谢流降低了6.9%。a(4)通过添加不同发酵维生素B族探究其对L-苏氨酸发酵的影响。本论文使用的维生素B有氯化胆碱(VB4)、烟酰胺(VB3)、泛酸钙(VB5)以及钴胺素(VB12),实验表明:添加氯化胆碱对L-苏氨酸的促进效果最显著,L-苏氨酸产量达到133.4g/L。VB3对L-苏氨酸发酵促进效果较显著,产量达到130.6g/L。添加甜菜碱盐酸盐、VB4和VB3的混合发酵促进剂,L-苏氨酸产量达到138.4g/L。(5)细胞循环发酵试验结果表明:离心分离发酵L-苏氨酸产量(达到141.4g/L)较不进行循环发酵提高了7.9%,效果优于陶瓷膜分离发酵。对细胞循环周期和循环发酵策略进行初步探究,发现在菌体循环周期16h,循环策略为V(上清液):V(浓缩液)=1:2时,L-苏氨酸产量最高,达到148.4g/L,较不进行循环发酵提高了13.1%。
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