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以骨质疏松(Osteoporosis,OP)为代表的骨代谢性疾病是一种发病率和危害性极高的骨相关性疾病。其主要表现为骨量降低、骨微结构受损、骨小梁减少、骨质变薄等,使得骨脆性增加并易发生骨折等风险;其严重危害着老年人及妇女的身体健康,已成为21世纪初人们广泛关注的社会问题之一。因此如何通过促进骨形成进而改善骨质疏松已成为目前研究的热点和难点问题。正常情况下骨代谢处于骨形成与骨吸收平衡的状态,使得骨量保持不变;若某种原因使得骨形成大于骨吸收,则可使骨量增加,进而可改善OP。因此针对调控骨形成的关键分子进行研究受到越来越多的关注,CKIP-1是近年来新发现的负调控骨形成分子,即该基因缺陷小鼠表现为骨形成速率增快、骨量增加、骨硬化。故CKIP-1基因可为骨质疏松等骨代谢相关疾病的防治提供新的思路,为此我们对该基因敲除小鼠进行研究。研究发现CKIP-1基因敲除小鼠的骨量及骨矿密度高于野生型,且颌骨与股骨的变化有差异,颌骨骨体积分数变化更加明显。间充质干细胞(Mesenchymal Stem Cells,MSCs)是具有多向分化潜能的一类细胞,在特定条件下可向成骨细胞、成纤维细胞、软骨细胞等分化。且有研究表明CKIP-1通过负调控MSCs的增殖及成骨分化能力而影响成骨。因此,我们推测CKIP-1是否通过影响不同部位MSCs的增殖及成骨分化能力进而导致不同部位骨量变化不一。目的:本研究拟借助CKIP-1基因敲除小鼠模型,首先通过新方法分离培养颌骨来源MSCs(Orofacial-bone-derived Mesenchymal Stem Cells,OMSCs)及股骨来源MSCs(Long-bone-marrow-derived Mesenchymal Stem Cells,BMMSCs),后经离体细胞和在体动物验证以明确CKIP-1通过影响不同部位MSCs成骨分化能力进而影响不同部位成骨。方法:1采用II型胶原酶消化法分离培养CKIP-1野生(Wildtype,WT)及敲除(knockout,ko)小鼠的omscs及bmmscs,后通过细胞形态观察,及流式细胞术检测细胞表面标记分子表达,证实所分离培养的细胞的来源和分析其生物学特性。2采用mtt及克隆形成实验,检测ckip-1缺失对omscs和bmmscs增殖能力影响;采用流式细胞术检测细胞凋亡实验,研究ckip-1缺失对omscs和bmmscs生物学特性影响。3对各细胞进行成骨、成脂诱导,检测各细胞的成骨和成脂分化能力。成骨诱导后行alp活性检测及茜素红染色,探讨ckip-1缺失对omscs和bmmscs成骨分化中早期及晚期分化的影响;成骨诱导后采用rt-pcr检测成骨分化相关分子(runx2、alp、coli、ocn)表达,探讨ckip-1缺失对omscs和bmmscs成骨分化相关分子的影响。经成脂诱导实验以检测各细胞的多向分化潜能,及ckip-1对mscs成脂能力的影响。4通过将成骨诱导的wt和ko小鼠omscs及bmmscs接种到羟基磷灰石/β-磷酸三钙(ha/β-tcp)上后植入到裸鼠皮下,并于2个月后处死取材,行he和masson三色染色,进一步体内验证ckip-1缺失对omscs和bmmscs成骨分化能力的影响。结果:1采用ii型胶原酶消化法可成功分离并培养出omscs和bmmscs。倒置显微镜观察可见各组细胞均生长良好,呈梭形或三角形。流式细胞术鉴定该类细胞均高表达干细胞表面标志分子(cd29、cd44和cd90),几乎不表达其他来源细胞的标志分子(cd31和cd34)。同时对不同细胞表面标志分子行定量分析,发现wt和ko小鼠颌骨及股骨分离的细胞表达干细胞表面标志分子的阳性率无统计学差异(p>0.05)。2采用mtt及平板克隆形成实验两种方法检测细胞增殖能力,结果均显示,mscs的增殖能力呈现:ko组大于wt组,且ckip-1敲除后omscs组增殖能力增加更加明显(p<0.05)。流式细胞术检测细胞凋亡结果显示,omscs与bmmscs凋亡率无统计学差异(p>0.05)。3成骨诱导后,采用alp活性染色和rt-pcr检测成骨向分化指标(runx2、alp),评估各组mscs的成骨向分化能力。alp染色深度及alp和runx2基因表达结果均表明,ko组大于wt组,且ckip-1敲除后omscs相应结果增加更加明显(p<0.05)。同样采用rt-pcr检测成骨相关指标(COL I、OCN)和行茜素红染色,以检测各组MSCs的成骨能力。同成骨向分化检测结果一致,MSCs的成骨能力也表现为,CKIP-1敲除后OMSCs组成骨能力增加更加明显(P<0.05)。成脂诱导结果表明,细胞均可成脂向分化,且CKIP-1敲除组成脂能力较强。4将载有细胞的支架材料植入到裸鼠皮下,2个月后处死取材行HE和Masson三色染色。大体照片可见四组均有纤维结缔组织形成且略有差异,KO组颌骨来源MSCs相对最多。Masson三色结果,提示四组均有大量的蓝色的纤维组织形成和一定量的骨形成,且各组间有一定差异,大体表现为KO组大于WT组,同时CKIP-1敲除后OMSCs组新生骨量增加更明显(P<0.05)。结论:1采用II型胶原酶消化法可成功分离OMSCs和BMMSCs,且CKIP-1及不同部位骨不影响干细胞表面标记分子的表达。2 CKIP-1基因敲除可显著增强OMSCs和BMMSCs的增殖能力,且OMSCs的增殖能力增加更加明显。3 CKIP-1基因敲除可显著增强OMSCs和BMMSCs的成骨分化能力,且OMSCs的成骨分化能力增加更加明显。4在体动物实验也证明CKIP-1基因敲除可显著增强MSCs的成骨分化能力,且OMSCs的成骨分化能力增加更加明显。综上所述,CKIP-1基因敲除后颌骨骨量较股骨增加更加明显,且产生这一现象的主要原因可能是CKIP-1敲除后OMSCs的增殖及成骨分化能力增加更加明显。