传染性支气管炎(IB)是由传染性支气管炎病毒(IBV)引起的急性、高度接触性传染病,可导致鸡呼吸困难、肾脏尿酸盐沉积及死亡,给养鸡业造成了很大的经济损失。TW Ⅰ型IBV毒株于1996年中国台湾首次发现。自2009年传入大陆后,该型毒株在我国迅速蔓延。近几年,TW Ⅰ型IBV毒株分离率大约占我国IBV分离株总数的15%,成为了我国仅次于QX型的IBV第二大流行优势基因型。本研究系统地评价了 TW Ⅰ型毒株对雏鸡及产蛋鸡的致病性,建立了该型毒株的RT-qPCR检测方法,有利于遏制该型病毒在我国的进一步流行。1.TW Ⅰ型IBV毒株对鸡的致病性评价(1)早期感染TW Ⅰ型IBV毒株的致病性将1日龄SPF雏鸡随机分配到试验组和对照组,每组70只。通过滴鼻点眼方式,试验组雏鸡分别接种105.5 EID50/0.1 mL TW Ⅰ型IBV AH1103株,对照组雏鸡经相同方式接种等体积PBS。在200天的试验观察内,评价两组鸡的临床表现、生长发育、及产蛋情况;定期采集样品,进行病理组织学检查和带毒、排毒情况检查。感染初期,试验组雏鸡出现呼吸道症状,气管和肺脏充血、出血,肾脏尿酸盐沉积,以及输卵管膨大积液,死亡率约为10%。育成期期间,试验组输卵管膨大积液病理现象更加严重,生殖系统发育缓慢。产蛋观察期间,试验组总产蛋量相较对照组下降了 26%,所产鸡蛋的浓蛋白更稀薄,且输卵管组织细胞病理损伤明显,卵黄性腹膜炎的发病率为50%;试验组鸡的泄殖腔内重新检测到具有感染力的病毒,并证明了盲肠扁桃体是病毒持续存在鸡体内的部位。TW Ⅰ型IBV对雏鸡呼吸道、肾脏和输卵管具有致病性,影响鸡输卵管发育,降低产蛋数量及蛋品质,从而降低了蛋鸡饲养的经济价值。(2)产蛋期感染TW Ⅰ型IBV毒株的致病性将8只200日龄SPF产蛋母鸡随机分配到试验组和对照组,每组4只。通过滴鼻点眼方式,试验组各母鸡分别接种105.5 EID50/0.1 mL TW Ⅰ型IBV AH1103株,对照组经相同方式接种等体积PBS。连续观察8天,比较两组鸡的临床表现及蛋品质,检测病毒感染组织细胞部位,测定各组织病毒载量。试验组母鸡表现出明显的呼吸道症状,总产蛋量、蛋黄均重及蛋壳厚度较对照组分别下降了 14.5%,3.35%及10.8%,而蛋内肉斑率则增加了 87.5%。组织内病毒载量测定结果显示,病毒含量由多到少依次为卵泡、伞部、子宫部、及峡部。免疫组化结果显示,病毒感染了输卵管组织上皮细胞。TW Ⅰ型IBV对产蛋鸡呼吸道和输卵管损伤明显,可造成产蛋率和蛋品质下降,影响蛋鸡养殖的经济效益及鸡蛋营养价值。2.检测TW Ⅰ型IBV反转录-实时荧光定量PCR方法的建立通过序列比对,发现不同基因型IBV毒株的S1基因间存在部分显著差异的区域,据此分别设计了两套引物和探针,建立了检测TW Ⅰ型IBV毒株的RT-qPCR方法。两套引物和探针组合建立的qPCR方法特异性良好,与包括QX、MASS、TC07-2、793B和LDT3-A型在内的其它基因型IBV毒株无交叉反应;敏感性良好,对101～109拷贝/μL浓度范围的底物均具有准确检测能力;重复性良好,其CT值组内变异系数均低于2%,组间变异系数均低于5%。两套引物和探针组合中的任意一套检测阳性均可做出阳性结果判断,且两套引物和探针组合的检测结果可以相互印证,该方法可用于对IB疑似病例中TW Ⅰ型IBV毒株的定向筛查。